Real-time Imaging von Leukotrien B 4 Vermittelte Zellmigration und BLT1 Wechselwirkungen mit β-Arrestin
Summary
Dieses Papier beschreibt die Methodik auf die chemotaktische Reaktion von Leukozyten an spezifische Liganden zu bestimmen und zu identifizieren Wechselwirkungen zwischen den Rezeptoren auf der Zelloberfläche und zytosolischen Proteinen unter Verwendung von Live Cell Imaging Verfahren.
Abstract
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) gehören zu den sieben Transmembran-Protein-Familie und vermitteln die Transduktion der extrazellulären Signale an intrazelluläre Reaktionen. GPCRs Kontrolle vielfältigen biologischen Funktionen wie Chemotaxis, intrazellulären Calcium-Freisetzung, Genregulation in einem Liganden abhängigen Art und Weise über heterotrimeren G-Proteine 1-2. Ligandenbindung induziert eine Reihe von Konformationsänderungen führt zu einer Aktivierung der heterotrimeren G-Proteine, die Ebenen der Botenstoffe wie zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP), Inositol-Triphosphat (IP3) und Diacylglycerol (DG) modulieren. Einhergehend mit Aktivierung des Rezeptors Ligandenbindung löst auch eine Reihe von Veranstaltungen an den Rezeptor Signalgebung über Desensibilisierung, Zwangsverwaltung und / oder Internalisierung zu dämpfen. Die Desensibilisierung Prozess der GPCRs erfolgt über Rezeptor-Phosphorylierung durch G-Protein-Rezeptor-Kinasen (GRKs) und die anschließende Bindung von β-arrestins 3. β-arrestins sind cytosolische Proteine und Translokation zur Membran auf GPCR-Aktivierung, die Bindung an phosphorylierte Rezeptoren (meistens) gibt es durch die Erleichterung des Rezeptor-Internalisierung 4-6.
Leukotrien B 4 (LTB 4) ist ein pro-inflammatorischen Lipidmolekül aus Arachidonsäureweg und vermittelt seine Aktionen über GPCRs, LTB 4-Rezeptor 1 (BLT1, ein Rezeptor mit hoher Affinität) abgeleitet und LTB 4-Rezeptor-2 (BLT2, ein Rezeptor mit niedriger Affinität ) 7-9. Die LTB 4-BLT1 Weg hat sich gezeigt, kritisch zu sein in mehrere entzündliche Erkrankungen wie Asthma, Arthritis und Atherosklerose 10-17. Das vorliegende Papier beschreibt die Methoden entwickelt, um LTB 4-induzierte Leukozyten-Migration und die Wechselwirkungen von BLT1 mit β-Arrestin und Rezeptor-Translokation in lebenden Zellen mit Mikroskopie-Techniken 18-19 überwachen.
Knochenmark abgeleiteten dendritischen Zellen aus C57BL / 6 Mäuse wurden isoliert und kultiviert wie zuvor 20-21 beschrieben. Diese Zellen wurden im Live Cell Imaging-Methoden getestet, um LTB 4 induzierten Zellmigration zu demonstrieren. Der menschliche BLT1 wurde mit rot fluoreszierendes Protein (RFP-BLT1) am C-Terminus und β-arrestin1 mit grün fluoreszierende Protein (β-arr-GFP) markiert markiert und transfizierten der beiden Plasmide in Rat Basophile Leukomia (RBL-2H3)-Zelllinien 18-19. Die Kinetik der Wechselwirkung zwischen diesen Proteinen und Lokalisation wurden unter Verwendung lebender Zellen Video-Mikroskopie. Die Methoden in der aktuellen Papier beschreiben die Verwendung von mikroskopischen Techniken, um die funktionellen Antworten von G-Protein-gekoppelte Rezeptoren in lebenden Zellen zu untersuchen. Das vorliegende Papier beschreibt auch die Verwendung von Metamorph Software, um die Fluoreszenz-Intensitäten zu quantifizieren, um die Kinetik der Rezeptor und cytosolische Protein-Interaktionen zu bestimmen.
Protocol
Discussion
Live Cell Imaging ist ein leistungsfähiges Werkzeug, um die Funktion und Wechselwirkungen der Proteine, wie sie in real-time auftreten zu demonstrieren. Die Methoden in diesem Manuskript beschrieben zeigen deutlich, dass LTB 4 kann eine schnelle Migration von dendritischen Zellen zu induzieren. Diese Methoden erweitern nicht nur die Aspekte der LTB 4-Funktion, um diverse Zelltypen, erlauben sie ähnliche Methoden, um eine Vielzahl von anderen Chemokinen angewendet werden und Prüfung ihrer Wirksam…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Forschung wird von den National Institutes of Health gewährt AI-52381, CA138623 und Kentucky Lung Cancer Research Board und institutionelle Unterstützung von James Graham Brown Cancer Center unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell lines: | ||||
| Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells. | ATCC | CRL-2256 | ||
| Media: | ||||
| Delbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | ||
| Phenol red free RPMI or DMEM | Invitrogen | 11835-030 | ||
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | ||
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030 | ||
| Penicillin-streptomycin (10000 U/mL) | Invitrogen | 15140 | ||
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300 | ||
| HEPES (1M) | Invitrogen | 15630 | ||
| Others: | ||||
| 35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish) | WPI | FD35-100 | ||
| Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad) | Bio-Rad | 16552088 | ||
| Instruments/software: | ||||
| Gene Pulser II electroporater | Bio-Rad | |||
| TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300 | Nikon | |||
| Metamorph Software | Universal Imaging | |||
| Vertical Micro-pipette puller | Narishige International | |||
| Micro-Forge M-900 | Narishige International | |||
| Hadraulic Micromanipulator MO-188NE | Narishige International | |||
| Coarse Manual Manipulator, MN-188NE | Narishige International | |||
| cDNA constructs: | ||||
| cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP) | Jala et al 2005 | |||
| cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (β-arrestin1-GFP in present study). | Jala et al 2005 |
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