ここで、我々は、マウス肺内皮細胞の単離と培養のためのプロトコルについて説明します。このメソッドは、メカニックと酵素肺組織の解離と同様に抗PECAM – 1とほとんどが微小血管起源の純粋な内皮細胞集団を生成する磁気ビーズへの結合抗ICAM – 2抗体を用いた2ステップ精製プロセスを含む。
内皮細胞は血管生物学の多くの分野で有用な研究モデルを提供しています。その最初の単離1日以来、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を入手し、文化に容易、便利であることが示され、したがって、最も広く研究されている内皮細胞であるしている。しかし、血管新生、透過性や他の多くのようなプロセスに焦点を当てた研究のために、微小血管内皮細胞(ECS)は、2を勉強するより生理学的に妥当なモデルです。さらに、ノックアウトマウスから単離されたECは、タンパク質の機能のex vivoでの解析のための有用なツールを提供しています。微小血管は異なる起源のEC分離と文化にいくつかのアプローチが3-7をこれまでに報告したが、純粋なECの一貫性のある分離および培養は、まだ多くの研究室の主要な技術的な問題です。れましたここで、我々は、単離および培養マウス肺内皮細胞(MLECs)の信頼性と比較的簡単な方法をステップバイステップのプロトコルを提供しています。このアプローチでは、6から得られた肺組織 – 8日齢の仔には、最初のコラゲナーゼ/ディスパーゼ(C / D)ソリューションで消化し、単一細胞懸濁液に機械的に分散し、小片に切断される。 MLECSは、磁性粒子のコンセントレータ(MPC)を使用してダイナビーズに結合した抗PECAM – 1抗体を用いてポジティブセレクションを使用して細胞懸濁液から精製されています。彼らがコンフルエントになるまで、そのような精製された細胞は、ゼラチンコート組織培養(TC)皿上で培養されています。その時点で、細胞はさらに抗ICAM – 2抗体に結合ダイナビーズを用いて精製されています。このプロトコルで得られたMLECsは、石畳の表現型を示す位相差光学顕微鏡などによって可視化、およびそれらの内皮表現型は、抗VE -カドヘリン8および抗VEGFR2 9抗体およびVE -カドヘリンの免疫蛍光染色とFACS分析を使用して確認されている。私たちの手で、この二段階の分離手順は、一貫性と信頼性をさらに培養することができるMLECs、の純粋な集団が得られます。このメソッドは、研究者が直接in vivoで観察された血管の表現型の分子機構を明らかにするために役立つため、孤立したMLECs上で実行し、in vitroでの実験の結果をin vivo試験で相関するノックアウトおよびトランスジェニックマウスの成長数の利点を受けることができるようになる。
微小血管内皮は、血管生物学の多くの分野で有用なモデルであることが証明されていると、より生理的に広く研究されているHUVECを3以上(例えば、血管新生)勉強に関連すると考えられている。以前に、それは微小血管内皮は腎臓、心臓、皮膚、網膜、脳、神経膠腫、脂肪組織や、肺2、4-7、10、11から得られることが報告されている。しかし、微小血管内皮単離するための一貫性と信頼性の高い方法が依然として必要です。ここに示す手順は、以前に発行されたプロトコルバージョン2の変形例であり、それは子犬ではなく、成熟した動物を使用する点で最も公開された手順とは異なります。若い動物からの細胞は高い増殖能を持ち、彼らの組織由来の培養は、細胞数の増加をもたらす傾向があるので、これはアイソレーションを成功させるために重要です。一週間古い動物が最適であると思われるが、より若いマウス(4日齢)を使用することもできます。私達は1つの子犬からMLECsを単離することに成功しているとしても、仔の上位または下位の数値は、必要に応じて使用することができます。しかし、分離のプロセスをスケールアップまたはダウンしながら、細胞の播種密度は、これがまた、細胞増殖に重要であるとして、変更されないままにしておく必要があります。 2ステップ精製抗PECAM – 1に結合した第一磁気ビーズを使用してMLECsの過程と抗ICAM – 2抗体よりは、前述のシングルステップ精製法よりも純粋なECの文化を得ることをはるかに効率的です。このプロトコルは、非常に手間のかかる手動のテクニック、勾配遠心分離し、繊維芽細胞、血液細胞と平滑筋細胞などの廃棄汚染セルの並べ替えを少なく効率的なFACSを使用する必要がなくなります。結果MLEC人口は血管新生反応、血管透過性及び白血球遊出のin vitroでの解析で 、癒しだけでなく、シグナル伝達経路の生化学的解析を巻かに使用することができます。必要に応じて、MLECsはそのようなトランス内皮抵抗(TER)測定のための免疫蛍光または電極アレイ用のフィブロネクチンまたはゼラチンコートしたカバースリップのような別の表面にめっきすることができる。得られた結果を直接ノックアウトおよびトランスジェニックマウス系統の増加のコンテキスト内で特に重要な生体内で観察された表現型、比較することができます。 in vivoで観察された欠陥の基礎となる細胞メカニズムのin vitroでの解析では、このメソッドの実装を成功させるには、すでに12を提示されている。
The authors have nothing to disclose.
この研究は米国心臓協会の助成金0950118G.to MC – Wによって部分的にサポートされていました。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Spring scissors | Fine Science Tools | 15032-13 | ||
forceps | Fine Science Tools | 11223-20 | ||
14G cannula | Fisher | 1482516N | ||
20 ml syringe | BD | 309661 | ||
BSA | Sigma-Aldrich | A7030-100G | ||
anti-rat IgG Dynabeads | Invitrogen | 110.35 | ||
Magnetic Particle Concentrator (MPC) | Invitrogen | 123-21D | ||
anti-mouse PECAM-1 antibody (CD-31) | BD Pharmingen | 553369 | ||
anti-mouse ICAM-2 antibody (CD-102) | BD Pharmingen | 553326 | ||
Collagenase/Dispase (C/D) | Roche Applied Science | 11097113001 | 100mg/ml stock solution can be prepared and stored at -20°C | |
DMEM | Cellgro Mediatech | 10-013-CV | ||
Bovine Skin Gelatin | Sigma-Aldrich | #G9391-100G | ||
Vasculife EnGS-Mv complete kit (VL) | Lifeline Cell Technology | LL0004 | ||
0.05% Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-052-CI | ||
Cell strainer 70 μm nylon | Falcon | 352350 | ||
tissue culture flask 75 cm2 | TPP | 90076 |