拟南芥 胚乳中印记基因DNA甲基化的测定

摘要

基因组印记是植物和哺乳动物繁殖过程中的一种现象。DNA甲基化在印记机制中起着重要作用。在拟南芥（Arabidopsis）中分离胚乳并确定印记基因的甲基化状态可能较为困难。本实验方案中，我们描述了如何分离胚乳，并通过亚硫酸氢盐测序法测定甲基化状态。

摘要

拟南芥 是一种研究表观遗传机制的优良模式生物。其中一个原因是其DNA甲基转移酶的功能缺失型空突变体具有 viability（存活能力），从而提供了一个研究基因组中DNA甲基化缺失如何影响生长和发育的系统。基因组印记（imprinting）是指母源和父源等位基因的差异表达，在哺乳动物和植物的生殖发育过程中发挥重要作用。DNA甲基化对于决定印记基因的母源或父源等位基因是否表达或沉默至关重要。在开花植物中，繁殖过程存在双受精事件：一个精子细胞与卵细胞融合形成胚胎，另一个精子则与中央细胞融合发育为胚乳。胚乳是植物中发生基因组印记的组织。 MEDEA，一个含有SET结构域的多梳群基因，以及 FWA，一种调控开花的转录因子，是首批被证实于胚乳中具有基因组印记现象的两个基因，其表达受植物中DNA甲基化与去甲基化的调控。为了确定某个基因在胚乳中的印记状态以及甲基化模式，我们首先需要能够分离出胚乳。由于种子非常微小，在 拟南芥，分离仍然具有挑战性 拟南芥 胚乳并检测其甲基化状态。在本视频方案中，我们介绍了如何进行遗传杂交、从种子中分离胚乳组织，以及通过亚硫酸氢盐测序确定甲基化状态。

方案

一、遗传杂交

1. 去除母本的雄蕊

为了利用DNA序列多态性区分母本和父本等位基因，需选择两种不同的生态型（例如 Columbia-0 (Col-0) 和 Ler）分别作为雌性亲本和雄性亲本。植株应保持幼嫩且健康。可通过解剖显微镜、放大头戴镜或肉眼对雌性亲本进行去雄操作。找到第12阶段的花（Smyth et al., 1990），用剪刀剪除其上方和下方的所有花或角果的花梗基部。将镊子尖端基部轻轻浸入盛有95%乙醇的烧杯中进行消毒，以去除镊子上可能附着的花粉粒并杀死花粉。用镊子轻轻拨开花蕾，小心去除4片萼片、4片花瓣和6枚雄蕊，仅保留裸露且完整的雌蕊。此过程中应尽量避免对子房造成损伤。

2. 选择花粉供体并进行授粉

最佳的花粉供体是处于第14阶段、花瓣与雌蕊呈90°角展开的开放花朵（Smyth et al., 1990），此时有大量花粉正在散出。用手握住花朵基部及花梗上方，即可使花朵展开。用花药轻擦已准备好的柱头。授粉后，柱头将被黄色花粉覆盖，在显微镜下可轻易观察到。

3. 标记杂交

对一株植物上所有去雄的雌蕊完成授粉后，我们使用珠宝标签标记杂交组合，并注明母本、父本信息及授粉....

讨论

将胚胎与胚乳和种皮分离相对容易，但将胚乳与种皮分开则较为繁琐，尤其是处于胚胎发生早期或中期鱼雷形阶段的种子。由于种皮所贡献的组织量极小，对于某些基因（例如 MEA 和 FWA），我们无需将胚乳与种皮分离。这意味着我们可以从胚乳和种皮组织的混合物中提取RNA，检测某个基因的母源和父源等位基因的表达情况，与胚胎中的表达进行比较，从而确定该基因的基因组印记状态。

对于亚硫酸氢盐测序，设计的引物需要具有链特异性。由于亚硫酸氢钠处理会损伤DNA模板，有时难以从经亚硫酸氢盐处理的基因组DNA中扩增出目标片段，因此我们通常尝试在不同区域设计多组PCR引物，并扩增较短的片段。在限制性内切酶消化后，基因组DNA必须完全变性为单链形式，因为亚硫酸氢盐介导的脱氨反应在双链DNA结构中的胞嘧啶残基上几乎无法进行。另一个关键点是亚硫酸氢盐处理必须彻底。如果已知未甲基化的胞嘧啶在亚硫酸氢盐测序中未转化为胸腺嘧啶，则表明亚硫酸氢盐处理未正确进行。此外，如果在未知区域中有大量胞嘧啶残基在亚硫酸氢盐测序中未转变为胸腺嘧啶，这极有可能是由于扩增了未完全转化的DNA，而非该区域所有.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
材料与试剂 <李>体视显微镜 <李>剪刀 <李>精细尖头镊子 <李>珠宝标签 <李>植物支撑杆 <李>细绳或扎线带 <李>4" X 2" X 8" 聚乙烯袋 <李>3" X 1" X 1.0 毫米显微镜载玻片 <李>液氮 <李>液氮容器 加热模块 PCR管 <李>PCR仪 <李>微量离心管 <李>微型离心机 <李>凝胶电泳实验室 <李>拟南芥 Columbia-0 植株 <李>拟南芥 Landsberg erecta 植株 试剂 <李>70% 乙醇 <李>95% 乙醇 <李>100% 乙醇 <李>0.3 M 甘露醇和 5 mM MES-pH 5.7 <李>十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） <李>100% 乙醇 <李>氯仿 <李>限制性内切酶 <李>3 M NaOH <李>6.3 M NaOH <李>6.24 M 尿素 / 4 M 亚硫酸氢钠 <李>无菌蒸馏 H2O <李>10 mM 对苯二酚 <李>Wizard DNA纯化系统（Promega） <李>10 M NH₃4OAc <李>20 μ克/ μL tRNA <李>TE缓冲液 <李>TOPO TA 克隆试剂盒（Invitrogen）