Импринтинг это явление в растительном и млекопитающих воспроизводства. Метилирование ДНК играет важную роль в механизмах импринтинга. Изоляция эндосперма и определения статуса метилирования генов в запечатлены Arabidopsis Может быть затруднено. В этом протоколе, мы описываем, как изолировать эндосперма и определять метилирование по бисульфит секвенирования.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Определение ДНК Метилирование запечатлены в генах Arabidopsis Эндосперм
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Arabidopsis thaliana является отличным организма модель для изучения эпигенетических механизмов. Одной из причин является потерей функции нулевой мутанта ДНК метилтрансферазы является жизнеспособным, обеспечивая тем самым система изучить, как потерю метилирования ДНК в геноме влияет на рост и развитие. Импринтинг означает дифференциальное выражение материнских и отцовских аллелей и играет важную роль в воспроизводстве развития как млекопитающих и растений. Метилирования ДНК имеет решающее значение для определения того, материнской или отцовской аллелей запечатлены ген экспрессируется или замолчать. В цветущих растений, есть двойное событие оплодотворение в воспроизводстве: один сперматозоид оплодотворяет яйцеклетку для формирования эмбриона и второго предохранители сперматозоидов с центральной ячейки вызвать эндосперма. Эндосперм ткани, где происходит печать в растениях. Медея, SET домена Polycomb группы генов, а FWA, транскрипционный фактор регулирующих цветение, это первые два гена, показано, что запечатлелось в эндосперма и их выражения контролируется метилирования ДНК и деметилирования растений. Для того чтобы определить статус импринтинга генов и метилирования в эндосперм, мы должны быть в состоянии изолировать эндосперма в первую очередь. Так как семена в крошечных Arabidopsis, она остается сложной, чтобы изолировать Arabidopsis эндосперма и изучить его метилирования. В этом видео-протокол, мы сообщаем о том, как проводить генетические крест, чтобы изолировать эндосперма ткани из семян, и для определения статуса метилирования путем секвенирования бисульфит.
Протокол
И. Генетическая Пересечение
1. Ослабление женский родитель
Для того чтобы отличить материнских и отцовских аллелей с помощью последовательности ДНК, полиморфизм, два разных экотипов, например, Columbia-0 (Col-0) и Лера, будет выбран как женские и мужские родителей. Растения должны быть молодыми и здоровыми. Можно кастрировать женский родитель с помощью рассекает микроскоп, увеличительное козырек, или невооруженным глазом. Найдите этап-12 цветов (Смит и соавт., 1990) и удалите все цветки или siliques выше и ниже их, закрепляя базе ножка с ножницами. Стерилизуйте пинцеты, опуская базе кончик аккуратно в стак....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Это сравнительно легко отделить зародыш от эндосперма и кожуры, но это утомительно отдельных эндоспермом от кожуры, особенно для семян в начале или в середине торпедо стадии эмбриогенеза. Так как семенная оболочка только способствует очень небольшое количество ткани, для некоторых генов, например, МЭС и FWA, мы не должны отделить эндоспермом от кожуры. Это означает, что мы можем выделить РНК из смеси эндосперма и тканей семенной кожуры, проверьте выражение материнских и отцовских аллелей гена, сравнить.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Авторы выражают благодарность г-жа Дженнифер М. Ломмеля и Тары Н. Rognan для поддержания Arabidopsis растений. Эта работа была поддержана запуска средства из Сент-Луиса университета и Национального института здоровья гранты 1R15GM086846-01 и 3R15GM086846-01S1 к В. Сяо.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
Запас
- Препаровальная лупа
- Ножницы
- Изобразительное Пинцет Совет
- Ювелирные изделия тегов
- Завод ставки
- Строка или Twist-связей
- 4 "x 2" x 8 "Мешки полиэтиленовые
- 3 "X 1" Х 1,0 мм слайды микроскоп
- Жидкий азот
- Жидкий азот Контейнеры
- Тепло Блок
- ПЦР трубы
- Термоциклер
- Микроцентрифуга трубы
- Микроцентрифуга
- Объекта гель-электрофореза
- Arabidopsis thaliana Columbia-0 Растения
- Arabidopsis thaliana Ландсберг erecta Растения
Реагенты
- 70% этанола
- 95% этанола
- 100% этанола
- 0,3 М сорбит и 5 мМ MES-рН 5,7
- Cetyltrimethyl бромид (СТАВ)
- 100% этанола
- Cholorform
- Рестриктаз
- 3 М NaOH
- 6,3 М NaOH
- 6,24 м карбамид / 4 M бисульфит натрия
- Стерильной дистиллированной H 2 O
- 10 мМ Гидрохинон
- Мастер ДНК Clean-Up системы (Promega)
- 10 М NH 4 OAc
- 20 мкг / мкл тРНК
- ТЕ-буфера
- ТОПО Т. А. Клонирование Kit (Invitrogen)
Ссылки
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
