La impresión es un fenómeno en la planta y reproducción de los mamíferos. Metilación del ADN juega un papel importante en los mecanismos de impresión. Aislar endospermo y determinar el estado de metilación de los genes impresos en Arabidopsis Puede ser difícil. En este protocolo, se describe cómo aislar endospermo y determinar la metilación de la secuenciación de bisulfito.
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Artículo de método
Determinación de la metilación del ADN de los genes impresos en Arabidopsis Endospermo
En este artículo
Resumen
Resumen
Arabidopsis thaliana es un organismo modelo excelente para estudiar los mecanismos epigenéticos. Una de las razones es el mutante nulo de pérdida de función de ADN metiltransferasa es viable, proporcionando así un sistema para estudiar cómo la pérdida de metilación del ADN en el genoma afecta el crecimiento y desarrollo. La impronta se refiere a la expresión diferencial de los alelos maternos y paternos, y juega un papel importante en el desarrollo de la reproducción, tanto en mamíferos y plantas. Metilación del ADN es fundamental para determinar si los alelos maternos y paternos de un gen impreso se expresa o se silencian. En las plantas con flores, hay un evento de doble fertilización en la reproducción: un espermatozoide fertiliza el óvulo para formar un embrión y el espermatozoide se fusiona con la célula de segundo central para dar lugar a endospermo. Endospermo es el tejido donde se produce en las plantas de impresión. MEDEA, un dominio establecido Polycomb gen del grupo, y la FWA, un factor de transcripción que regulan la floración, son los dos primeros genes demostrado ser impreso en el endospermo y su expresión está controlada por la metilación del ADN y desmetilación en las plantas. Con el fin de determinar el estado de impresión de un gen y el patrón de metilación en el endospermo, tenemos que ser capaces de aislar primero endospermo. Desde la semilla es muy pequeña en Arabidopsis, que sigue siendo un reto para aislar endospermo Arabidopsis y examinar su metilación. En este protocolo de vídeo, se presenta la manera de realizar un cruce genético, para aislar el tejido del endospermo de las semillas, y para determinar el estado de metilación de la secuenciación de bisulfito.
Protocolo
I. genética Cruce
1. Castrando el progenitor femenino
Con el fin de distinguir los alelos maternos y paternos mediante el uso de polimorfismo de secuencia de ADN, dos ecotipos diferentes, por ejemplo, Columbia-0 (Col-0) y Ler, será elegido como padres de familia femenino y masculino. Las plantas deben ser joven y saludable. Se puede castrar el progenitor femenino mediante el uso de un microscopio de disección, de aumento visor, o el ojo desnudo. Localizar 12 etapa flores (Smyth et al., 1990) y quitar cualquier flor o silicuas por encima y por debajo de ellos por el recorte de la base del pedúnculo con las ....
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Discusión
Es relativamente fácil de separar del embrión y endospermo cubierta de la semilla, pero es tedioso para separar el endospermo de la cáscara de la semilla, especialmente para las semillas en la etapa de principios o mediados de torpedo de la embriogénesis. Desde cubierta de la semilla sólo aporta una pequeña cantidad de tejido, para algunos genes, por ejemplo, MEA y FWA, no hay que separar el endospermo de la cáscara de la semilla. Esto significa que podemos aislar ARN a partir de una mezcla de endosper.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Los autores agradecen a la Sra. Jennifer M. Lommel y Tara N. Rognan para el mantenimiento de plantas de Arabidopsis. Este trabajo fue apoyado por la puesta en marcha de fondos de la Universidad de Saint Louis y los Institutos Nacionales de Salud subvenciones 1R15GM086846-01 y 3R15GM086846-01S1 a W. Xiao.
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Materiales
Suministros
- Microscopio de disección
- Tijeras
- Pinzas de punta fina
- Joyas de la etiqueta
- Las estacas de plantas
- Cuerdas o cintas de cierre
- 4 "X 2" X 8 "Bolsas de Polietileno
- 3 "x 1" x 1.0 mm Micropreparados
- El nitrógeno líquido
- Los contenedores de nitrógeno líquido
- Bloquear el calor
- Tubos para PCR
- Termociclador
- Tubos de microcentrífuga
- Microcentrífuga
- Gel de electroforesis de instalación
- Arabidopsis thaliana Columbia-0 plantas
- Arabidopsis thaliana Landsberg erecta plantas
Reactivos
- 70% de etanol
- Etanol al 95%
- 100% de etanol
- 0,3 M sorbitol y 5 mM MES, pH 5,7
- Bromuro de amonio cetiltrimetil (CTAB)
- 100% de etanol
- Cholorform
- Las enzimas de restricción
- 3 M NaOH
- 6,3 M NaOH
- 6,24 M de urea / 4 bisulfito de sodio M
- Destilada estéril H 2 O
- 10 mM hidroquinona
- Asistente de ADN Clean-Up System (Promega)
- 10 M NH 4 OAc
- 20 mg / l tRNA
- Tampón TE
- El kit de clonación TOPO TA (Invitrogen)
Referencias
- Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. High sensitivity mapping of methylated cytosines. Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).
- Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E.
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Reimpresiones y permisos
