Isolering och In vitro Aktivering av Caenorhabditis elegans Spermier
Summary
Ett protokoll för isolering och aktivera spermatider från manliga<em> C. elegans</em> Beskrivs här. Kapning den bakre änden av manliga releaser spermatider. Den spermatider kan aktiveras genom tillsats av proteashämmare.
Abstract
Män och hermafroditer är de två som finns naturligt sexuella former i nematoden C. elegans. Den amöboid spermier produceras av både män och hermafroditer. I den tidigare fasen av gametogenes, könscellerna av hermafroditer differentieras till begränsat antal spermier – runt 300 – och lagras i en liten "väska" som kallas spermatheca. Senare hermafroditer kontinuerligt producera ägg 1. Däremot män producerar uteslutande spermier under hela vuxenlivet. Hanarna producerar så mycket sperma att det står för> 50% av den totala celler i en typisk vuxen mask 2. Därför isolera spermier från män är lättare än den som använts för hermafroditer.
Endast en liten andel män är naturligtvis genereras på grund av spontana icke-disjunktion av X-kromosom 3. Crossing hermafroditer med män eller mer bekvämt, införandet av mutationer kan ge upphov till Honom (hög förekomst av hanar) fenotyp är några av strategier genom vilka man kan berika den manliga befolkningen 3.
Hanar kan lätt skiljas från hermafroditer genom att observera 4 svansen morfologi. Hermafrodit svans är spetsiga, medan manliga svans avrundas med parning strukturer.
Kapning svansen släpper stora antalet spermatider lagras i manliga genitalia. Dissektion utförs under lupp med 27 gauge nålar. Eftersom spermatider inte är fysiskt sammankopplade med andra celler, fördriver hydraultryck interna innehållet i manliga kroppen, inklusive spermatider 2.
Hanarna är direkt dissekeras på en liten droppe "Sperm Medium". Spermatider är känsliga för förändringar i pH. Därför är HEPES, en förening med god buffertkapacitet används i spermier medier. Glukos och andra salter som finns i spermier medier bidra till att upprätthålla osmotiskt tryck att bibehålla integriteten av spermier.
Post-meiotiska differentiering av spermatider in spermier kallas spermiogenesis eller spermier aktivering. Skakningar 5, och Nelson 6 tidigare visat att runt spermatider kan fås att differentieras till spermier genom att lägga till olika aktivera föreningar inklusive Pronase E. Här visar vi in vitro spermiogenesis av C. elegans spermatider med Pronase E.
Framgångsrik spermiogenesis är förutsättning för fruktbarhet och därmed mutanter defekt i spermiogenesis är sterilt. Hittills flera mutanter har visat sig vara defekta specifikt i spermiogenesis processen 7. Onormalt upptäcks vid in vitro-aktivering av nya Spe (spermatogenesen defekt) mutanter skulle hjälpa oss att upptäcka ytterligare spelare som deltar i detta evenemang.
Protocol
Discussion
Förutom att analysera Spe mutanter, har detta protokoll andra viktiga program, till exempel analysera spermamorfologin med åldrandet. Spermatider och isolerade spermier med hjälp av det här protokollet kan användas i andra nedströms experiment som, immunfärgning av vildtyp och muterade spermier 8, 9, motilitet spermier på bilderna 10, fysiologiska mätningar 9, 11, eller till och med insemination 12.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Samuel Ward, skakar Diane C. och Gregory Nelson för banbrytande denna teknik. Vi tackar Pavan Kadandale och Brian Geldziler för videor som visar aktiveras spermier, medlemmar av Singson labb för bra diskussioner, CGC för stammar och NIH för att stödja oss genom bidrag (R01HD054681).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Tuberculin syringe | Becton Dickinson | 309623 | Syringe: 1 ml, needle: 27G X ½ in |
|
| Pap pen | Zymed | 00-8888 | ||
| VWR VistaVision HistoBond Microscope Slides |
VWR International | 16004-406 | Dimension: 75X25X1mm |
|
| Cover glass | VWR International | 48366045 | ||
| Protease | Sigma | P-6911 |
References
- Kimble, J., Crittenden, S. L. Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).
- Lhernault, S. W., Roberts, T. M. . Methods in Cell Biology. , 273-301 (1995).
- Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans. Genetics. 91, 67-94 (1979).
- Altun, Z. F., Hall, D. H. Introduction to male C. elegans anatomy. WormAtlas. , (2008).
- Shakes, D., Ward, S. Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis. Dev Biol. 134, 189-200 (1989).
- Nelson, G. A., Ward, S. Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin. Cell. 19, 457-464 (1980).
- L’Hernault, S. W. The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans. Molecular and Cellular Endocrinology. 306, 59-65 (2009).
- Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D., Singson, A. The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization. Development. 132, 2795-2808 (2005).
- Xu, X., Sternberg, P. A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization. Cell. 114, 285-297 (2003).
- Nelson, G., Roberts, T., Ward, S. Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin. J Cell Biol. 92, 121-131 (1982).
- Machaca, K., DeFelice, L. J., L’Hernault, S. W. A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation. Dev Biol. 176, 1-16 (1996).
- LaMunyon, C., Ward, S. Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans. Genetics. 138, 689-692 (1994).
