생체내 및 아답터 - clathrin 상호 작용의 체외 연구에서
Summary
Clathrin – 중재 endocytosis는 화물선 선택과 clathrin 코트 어셈블리를 조정 어댑터 단백질에 따라 달라집니다. 우리가 모델로 효모 endocytic 어댑터 단백질 Sla1p를 사용하여 어댑터 clathrin 물리적 상호 작용과 라이브 셀 이미징 방법을 연구하는 절차를 설명합니다.
Abstract
주요 endocytic 통로가 세포 표면부터 수송화물 1-6 endosomes 것을 clathrin – 코팅 vesicles (CCVs)의 형성과 함께 시작합니다. CCVs는 clathrin되는 외투 소포 막의 polyhedral 격자에 의해 구별하고 기계 발판 역할을하고 있습니다. Clathrin 코팅은 개별 clathrin triskelia 세 무거운 세 가벼운 체인 7,8 subunits로 구성된 clathrin의 수용성 형태의 소포 형성하는 동안 조립하고 있습니다. triskelion 직접 멤브레인에 바인딩하는 기능이 없기 때문에, clathrin 바인딩 어댑터 lipids 및 / 또는 멤브레인 단백질 9 협회를 통해 막으로 형성 clathrin 격자를 연결하기 위해 중요하다. Adaptors 또한 패키지 transmembrane 단백질과 같은 수용체와 같은화물, 그리고 서로와 CCV 형성 기계 9 다른 구성 요소와 상호 작용할 수 있습니다.
스물 이상 clathrin 어댑터는 설명했습니다 몇 가지는 clathrin 매개 endocytosis에 관여하고 다른 사람들은 트랜스 잠돌군 Zz 네트워크에 집중하거나 9 endosomes. HIP1R (효모 Sla2p)를 제외하고, 모든 알려진 clathrin 어댑터 clathrin 중쇄 9 N – 터미널 – 프로펠러 도메인에 바인딩합니다. Clathrin 어댑터는 구조화되지 않은 유연한 linkers로 연결되어 접힌 도메인으로 구성된 모듈형 단백질입니다. 이 링커 지역 내에서 짧은 바인딩 모티프는 clathrin N – 말단 도메인이나 소포 형성 기계 9 다른 구성 요소와 상호 작용을 중재. 별개의 두 clathrin 결합 모티프가 정의되었다 : clathrin – 상자와 W – 박스 9. 합의 clathrin 박스 순서는 원래로 정의했습니다 L [L / I] [D / E / N] [L / F] [D / E] 10 그러나 변종이 이후 11 발견되었습니다. W – 박스 시퀀스 PWxxW (여기서 x는 모든 찌꺼기가 어디)에 부합.
Sla1p는 (굴지 바인딩 단백질 1 합성 치명적인) 원래 굴지 관련 단백질로 식별 및 효모 세포 12 endocytic 사이트에서 정상적인 굴지의 cytoskeleton의 구조와 역학에 대한 필요했습니다. Sla1p 또한 NPFxD endocytic 정렬 신호를 바인딩하고 NPFxD 신호 13,14 베어링화물의 endocytosis를 위해 중요합니다. 최근 Sla1p는 clathrin 상자 LLDLQ과 비슷한 모티프를 통해 clathrin 바인딩하는 시연 되었음 변종 clathrin – 박스 (VCB)라고합니다, 그리고 endocytic clathrin 어댑터 15 기능. 또한, Sla1p 라이브 세포 형광 현미경 연구 16 endocytic 코트에 널리 사용되는 마커되고 있습니다. 여기 어댑터 clathrin 상호 작용 연구를위한 방법을 설명하는 모델로 Sla1p를 사용합니다. 우리가 사는 세포 형광 현미경에 초점을 아래로 GST – 끌어와 공동 immunoprecipitation 방법.
Protocol
Discussion
Clathrin – 코팅 vesicles (CCV)는 트랜스 잠돌군 Zz 네트워크에서 endocytosis 및 수송에 참여하고, 진핵 세포 생물에 근본 아르 보존 경로를 endosomes. 이 방법은 종이에 설명된 접근 어댑터 단백질과 clathrin 사이에 특히 상호 작용에 CCV 형성에 책임이있는 분자 메커니즘을 연구하는 데 유용합니다. GST – 융합 단백질의 선호도와 공동 immunoprecipitation의 assays는 어댑터 (후보)와 clathrin 사이의 물리적인 연?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DF는 박사 교제에 NSF 교량에 의해 지원됩니다. 이 작품에 사용되는 현미경은 콜로라도 주립 대학에서 현미경 이미징 네트워크 코어 인프라 부여에 의해 부분적으로 지원됩니다. 저자의 실험실에서 clathrin 어댑터에 대한 작업은 CSU 시작 자금과 SD로 미국 심장 협회 상을 09SDG2280525 지원합니다
Materials
| Material | Company |
|---|---|
| QuickChange-XL site-directed mutagenesis kit | Stratagene |
| protease inhibitor cocktail | Sigma |
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