הפקה של חילוץ העובר צ'יק לגידול Murine בתאי גזע עצביים קרסט
Summary
כדי לטפח גזע עצביים לפסגה תאים (NCSC) במבחנה, בינוני מיוחד (NCSCM) נדרשת. חלק חיוני של NCSCM הוא עובר אפרוח לחלץ (CEE). כאן אנו מתארים טכניקות מדויקות כדי לייצר כמות מוגדל של איכות CEE טהור גבוהה, כולל פרטים כמו בידוד, מסמוס, צנטריפוגה, תהליכי סינון.
Abstract
הרכס העצבי נובעת האאקטודרם נוירו במהלך embryogenesis ואת נמשכת רק באופן זמני. ניסויים מוקדמים כבר proofed ובתאים pluripotent להיות חלק אינטגרלי של הרכס העצבי 1. Phenotypically, בתאי גזע עצביים לפסגה (NCSC) מוגדרים בו זמנית על ידי הבעת p75 (נמוך המאוחד גורם גדילה עצבי קולטן, LNGFR) ו SOX10 במהלך הנדידה שלהם מן הרכס העצבי 2,3,4,5. אלה ובתאים יכולים להתמיין לתאי שריר חלק, chromaffin התאים, נוירונים ותאי גלייה, כמו גם מלנוציטים, סחוס ועצם 6,7,8,9. כדי לטפח NCSC במבחנה, גזע מיוחד הרכס העצבי בינוני תא (NCSCM) נדרש 10. החלק המורכב ביותר של NCSCM היא הכנת תמצית חומוס העובר (CEE) המייצג מקור חיוני של גורמי גדילה עבור NCSC כמו גם עבור סוגים אחרים של explants עצביים. מרכיבים אחרים NCSCM ליד CEE זמינים מסחרית. הפקת CCE באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי יש חשיבות גבוהה לדעת את הפרטים מאתגר כמו בידוד, מסמוס, צנטריפוגה, תהליכי סינון. בפרוטוקול זה אנו מתארים טכניקות מדויקות כדי לייצר כמות מוגדל של איכות CEE טהור גבוהה.
Protocol
Discussion
פרוטוקול זה מבוסס על שינויים של נהלים אשר תוארו 10,11 האחרונות. בנוסף לפרסומים לשעבר אנחנו כאן להראות את השלבים השונים של תהליך אישי מורחב יותר. זו תומכת הנסיין עם פרטים חשובים להבטחת ההליכים הנכונים תוצאות אמינות. יתר על כן, כאשר תהליך הניתוח הוא חלק חיוני להפקת C…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
התמיכה והייעוץ של מרקוס Pajtler ורוברט Bohrer היו שלא יסולא בפז עבור להדמיה של פרוטוקול זה.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 11 days incubated chicken eggs | Sörries-Trockels Vermehrungszucht GmbH & Co.KG | |||
| Alcoholic disinfection spray | Schülke & Mayr GmbH | |||
| DMEMGlutamax | GIBCO Invitrogen | |||
| Syringe sterile (60 ml) | BD Biosciences | |||
| Tubes sterile (50; 15 ml) | Greiner Bio-One GmbH | |||
| Pipet tips sterile | Starlab GmbH | |||
| Hyaluronidase typeIV-S | Sigma-Aldrich | |||
| Milipore stericups sterile (0.45; 0.22 μl) | Fisher Scientific AG | |||
| Pipettes sterile (25; 10; 5 ml) | Greiner Bio-One GmbH | |||
| Centrifuge L5-50 | Rotor type Ti-45 |
References
- Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Cell lineage analysis reveals multipotency of some avian neural crest cells. Nature. 335, 161-164 (1988).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Rao, M. S., Anderson, D. J. Immortalization and controlled in vitro differentiation of murine multipotent neural crest stem cells. J Neurobiol. 32, 722-746 (1997).
- Paratore, C., Goerich, D. E., Suter, U., Wegner, M., Sommer, L. Survival and glial fate acquisition of neural crest cells are regulated by an interplay between the transcription factor Sox10 and extrinsic combinatorial signaling. Cell. 128, 3949-3961 (2001).
- Kim, J., Lo, L., Dormand, E., Anderson, D. J. SOX10 maintains multipotency and inhibits neuronal differentiation of neural crest stem cells. Neuron. 38, 17-31 (2003).
- Anderson, D. J., Groves, A., Lo, L., Ma, Q., Rao, M., Shah, N. M., Sommer, L. Cell lineage determination and the control of neuronal identity in the neural crest. Review Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 62, 493-504 (1997).
- Dorsky, R. I., Moon, R. T., Raible, D. W. Environmental signals and cell fate specification in premigratory neural crest. Review Bioessays. 22, 708-716 (2000).
- Sieber-Blum, M. Factors controlling lineage specification in the neural crest. Int Rev Cytol. 197, 1-33 (2000).
- Dupin, E., Real, C., Ledouarin, N. The neural crest stem cells: control of neural crest cell fate and plasticity by endothelin-3. Int Rev Cytol. 73, 533-545 (2001).
- Maurer, J., Fuchs, S., Jäger, R., Kurz, B., Sommer, L., Schorle, H. Establishment and controlled differentiation of neural crest stem cell lines using conditional transgenesis. Differentiation. 75, 890-891 (2007).
- Wu, Y. Y., Mujtaba, T., Rao, M. S. Isolation of stem and precursor cells from fetal tissue. Methods Mol Biol. 198, 29-40 (2002).
