Produzione di estratto di Chick dell'embrione per la coltivazione delle cellule della cresta neurale Murine staminali

Summary

Per coltivare le cellule staminali neurali cresta (NCSC) in vitro, un mezzo speciale (NCSCM) è obbligatorio. Parte essenziale della NCSCM è embrione estratto di pulcino (CEE). Noi qui descrivere le tecniche accurate per produrre una quantità di massimizzare la qualità CEE pura e alta, compresi i dettagli come l'isolamento, la macerazione, centrifugazione, filtrazione e processi.

Abstract

La cresta neurale nasce dalla neuro-ectoderma durante l'embriogenesi e persiste solo temporaneamente. Primi esperimenti già prova di cellule progenitrici pluripotenti di essere parte integrante della cresta neurale ^1. Fenotipicamente, le cellule staminali neurali cresta (NCSC) sono definite dal simultaneamente esprimendo p75 (affine a basso fattore di crescita dei recettori nervosi, LNGFR) e SOX10 durante la loro migrazione dalla cresta neurale ^2,3,4,5. Queste cellule staminali possono differenziarsi in cellule muscolari lisce, cellule cromaffini, neuroni e cellule gliali, così come melanociti, cartilagine e osso ^6,7,8,9. Per coltivare NCSC in vitro, uno speciale medium cresta neurale delle cellule staminali (NCSCM) è richiesto ^10. La parte più complessa del NCSCM è la preparazione di estratto pulcino dell'embrione (CEE) che rappresenta una fonte essenziale di fattori di crescita per il NCSC così come per altri tipi di espianti neurale. Altri ingredienti NCSCM accanto CEE sono disponibili in commercio. Produrre CCE uso di apparecchiature di laboratorio standard è di grande importanza per conoscere i dettagli impegnativo come l'isolamento, la macerazione, centrifugazione, filtrazione e processi. In questo protocollo si descrivono le tecniche accurate per produrre una quantità di massimizzare la qualità CEE pura e alta.

Protocol

Gli autori affermano che gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le Comunità europee direttiva del Consiglio (86/609/CEE), seguendo le linee guida del NIH per quanto riguarda la cura e l'uso di animali nelle procedure sperimentali e le norme stabilite dalla Animal Istituzionale Cura e uso Comitato (IACUC) presso l'Università di Duisburg-Essen (Germania).

Parte 1: Impostazione (non mostrato in video)

PREPARAZIONE MATERIALI E SOLUZIONI (prima di prendere le uova fuori dell'incubatore)

• Le uova devono essere incubate in un incubatore umidificato per 11 giorni a 37....

Discussion

Questo protocollo si basa su modificazioni delle procedure che sono state descritte in passato ^10,11. Oltre alle pubblicazioni precedenti abbiamo qui mostrare le singole fasi diverse del processo più esteso. Questo sostiene lo sperimentatore con dettagli importanti garantendo procedimenti corretti e risultati affidabili. Inoltre, come il processo di dissezione è una parte essenziale di estrazione CEE descriviamo la procedura di presa degli embrioni fuori dal sacco vitellino in ogni dettaglio. Ci sono diversi .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
11 giorni uova di gallina incubate	Sorries-Trockels Vermehrungszucht GmbH
Spray disinfettante alcolico	Schü lke Mayr GmbH
DMEMGlutamax	GIBCO, by Life Technologies
Siringa sterile (60 ml)	BD Biosciences
Provette sterili (50; 15 ml)	Greiner Bio-One
Puntali per pipette sterili	Starlab GmbH
Ialuronidasi tipoIV-S	Sigma-Aldrich
Milipore stericups sterili (0,45; 0,22 μ l)	Fisher Scientific
Pipette sterili (25; 10; 5 ml)	Greiner Bio-One
Centrifuga L5-50	Rotore tipo Ti-45