Microdissection av Black Widow Spider Silk-körtlar
Summary
Här beskriver vi en effektiv strategi för att ta bort siden-producerande körtlar från buken av kvinnliga svarta änkan. Detta förfarande möjliggör en snabb isolering av de sju olika siden-körtlar i en mycket renat mode, en viktig process för utredarna att studera spindeltråd produktion och fiber montering.
Abstract
Moderna spindlar spin högpresterande siden fibrer med ett brett utbud av biologiska funktioner, inklusive förflyttning, rov fånga och skydd för att utveckla avkomma 1,2. Spindlar utföra dessa uppgifter genom att snurra flera olika fibertyper som har olika mekaniska egenskaper. En sådan specialisering av fibertyper har skett genom utvecklingen av olika siden-körtlar, som fungerar som små biofactories. Dessa biofactories tillverka och lagra stora mängder silkesproteiner för fiberproduktion. Genom en komplex serie av biokemiska händelser, dessa silkesproteiner omvandlas från en vätska i ett fast material vid extrudering.
Mekaniska studier har visat att spindeln silke är starkare än höghållfast stål 3. Analyser för att förstå förhållandet mellan struktur och funktion spindeltråd trådar har visat att spindeltråd stor del består av proteiner, eller fibroins, som blockerar upprepar inom sina proteinsekvenser 4. Vanliga molekylära signaturer som bidrar till den otroliga draghållfasthet och töjbarhet av spindel siden är repas genom analyser av översatta siden cDNAs. Med tanke på de extraordinära materialegenskaper av spindel silke, finns forskningslaboratorier över hela världen racing att förstå och efterlikna spinnprocess att producera syntetiskt silke fibrer för kommersiella, militära och industriella applikationer. En av de största utmaningarna för spinning konstgjord spindeltråd i forskningen labbet innebär en fullständig förståelse av de biokemiska processer som sker under extrudering av fibrer från silke-producerande körtlar.
Här presenterar vi en metod för isolering av de sju olika siden-producerande körtlar från cobweaving svarta änkan spindel, vilket inkluderar större och mindre ampullate körtlar [tillverkar Kran och byggnadsställningar siden] 5,6, tubuliform [syntetiserar ägg fall silke] 7 , 8, flagelliform [okänd funktion i cob-väverskor], sammanlagt [gör lim siden] aciniform [syntetiserar bytesdjur inslagning och ägg trådar fall] 9 och päronformade [producerar bifogad skiva siden] 10. Detta synsätt bygger på anesthetizing spindeln med koldioxid, efter avskiljandet av cephalothorax från buken och microdissection av buken för att få silke-producerande körtlar. Efter separation av de olika siden-producerande körtlar, kan dessa vävnader användas för att hämta olika makromolekyler för olika biokemiska analyser, inklusive kvantitativa realtids-PCR, norra-och västra blotting, masspektrometri (MS eller MS / MS) analyser för att identifiera New Silk protein-sekvenser, söka efter proteiner som deltar i siden montering väg, eller använd intakt vävnad för cellodling eller histologiska experiment.
Protocol
Discussion
Vår metod för microdissection av siden-producerande körtlar från svarta änkan spindel erbjuder ett effektivt sätt att få mycket rent silke-producerande körtlar. Dissektioner kan fyllas i 1,5 till 3 timmar, vilket ger en komplett uppsättning av de sju olika siden-producerande körtlar från cobweavers. Att få mycket rent silke-körtel prov innebär utredarna förmågan att utföra ett brett spektrum av biokemiska studier, inklusive identifiering av nya siden eller proteiner förkläde lagras i glandulära lumin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av en NSF RUI Grant rätt MCB-0950372 Molekylär karakterisering av Black Silks Widow Spider.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium chloride | EM Science | SX0420-1 | 0.1 M in water | |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D-5758 – 5 ml | 0.1% v/v | |
| Sodium citrate | Sigma | S1804 – 1 kg | 0.015 M in water | |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | ||
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software – Leica Application Suite v2.8.1 | |
| Vannas scissors | World Precision Instruments | 500260 | ||
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments | 501764 | Mini Dumont #M5S | |
| Insect pins | Indigo Instruments | 33414-2 | Insect pins #2 | |
| Small or large dissection dishes | Living Systems Instrumentation | DD-50-S or DD-90-S | 52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm | |
| Drosophila culture vials | Carolina Biological Supply Company | FR-17-3076 | Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm |
References
- Vollrath, F., Knight, D. P. . Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. . J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).
- Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. . Endeavour. 10, 31-31 (1986).
- Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. . Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).
- Lewis, R. V., Xu, M. . Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).
- Colgin, M. A., Lewis, R. V. . Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).
- Tian, M., Lewis, R. V. . Appl. Phys. A-Mater. 82, 265-265 (2006).
- Hu, X., Lawrence, B., Kohler, K. . Biochemistry. 44 (30), 10020-10020 (2005).
- Vasanthavada, K., Hu, X., Falick, A. M. . J Biol Chem. 282 (48), 35088-35088 (2007).
- Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. V. . Mol. Biol. Evol.. 21 (10), 1950-1950 (2004).
- Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L. . J Biol Chem. 284 (42), 29097-29097 (2009).
