Transfecting células-tronco neurais com o Nucleofector Amaxa
Summary
Introdução de um gene de interesse em uma célula é um método poderoso para elucidar a sua função in vivo. Este protocolo descreve um método eficiente de uma cultura de transfecting-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), utilizando o aparelho de eletroporação Nucleofector feita por Amaxa.
Abstract
Transfecção de células primárias de mamíferos neural, tais como tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), comumente usado com os reagentes de transfecção catiônicas lipídicas resultou muitas vezes na viabilidade celular pobres e eficiência de transfecção baixo. Outros métodos mecânicos de introduzir um gene de interesse, como uma arma gene ou microinjeção, também são limitados pela viabilidade celular pobres e baixos números de células transfectadas. A estratégia de usar construções viral para introduzir um gene exógeno em células primárias tem sido condicionada pela quantidade de tempo e trabalho necessário para criar vetores virais e preocupações de segurança em potencial. Descrevemos aqui um protocolo passo a passo para transfecting hNSPCs utilizando dispositivo Nucleofector Amaxa e tecnologia com os parâmetros elétricos atuais e soluções tampão especificamente otimizados para transfecting células-tronco neurais. Usando este protocolo, conseguimos a eficiência de transfecção inicial de ~ 35% e ~ 70% após transfecção estável. O protocolo envolve combinando um elevado número de hNSPCs com o DNA para ser transfectadas no buffer apropriada, seguida de eletroporação com o dispositivo Nucleofector.
Protocol
Discussion
Este protocolo descreve um procedimento de transfecção relativamente rápida e eficiente para hNSPCs. Usando este procedimento, obtivemos a eficiência de transfecção inicial de ~ 35%. Células transfectadas por este procedimento pode ser usado para estudos de curto prazo (células transfectadas transitoriamente) ou para estudos de longo prazo se um agente de seleção é usado para gerar uma população estável transfectadas. Geramos células transfectadas estavelmente em que ~ 70% das células expressam a proteína exógena. Em hNSPC…
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer o Dr. Philip H. Schwartz da Célula de Recursos Humanos Neural Stem Nacional do Hospital Infantil s, Orange County Instituto de Pesquisa para a prestação de culturas hNSPC.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| The Nucleofector Device | Tool | Amaxa | AAD-1001 | |
| Mouse neural stem cell nucleofector kit | Reagent | Amaxa | VPG-1004 |
References
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