Ici nous démontrons un protocole pour mener à bien coloration de cellules vivantes qui peuvent être utilisés pour détecter les récepteurs olfactifs à la surface des cellules HEK293T commodément. En outre, il peut également être utilisé pour le dosage de l'expression de surface d'autres récepteurs chimiosensoriels ou RCPG.
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Article de méthode
Dosage expression en surface des récepteurs chimiosensoriels dans des cellules hétérologues
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le monde des odeurs vives est reconnu par le sens de l'olfaction. Olfaction chez la souris est médiée par un répertoire d'environ 1200 récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) 1 qui sont postulés pour lier les molécules odorantes volatiles et en convertissant le signal extracellulaire en signal intracellulaire par couplage avec la protéine G Gαolf. La liaison de l'odorants aux récepteurs est pensé pour suivre une règle combinatoire, qui est, un odorant peut lier plusieurs récepteurs et un récepteur peut se lier plusieurs molécules odorantes à des degrés divers 2. Biochimiques, la signalisation et des études de liaison ligand ont été commodément effectuée pour la plupart des RCPG en utilisant des cellules hétérologues. Cependant l'utilisation de cellules hétérologues pour l'étude des récepteurs olfactifs, a été exclue pour un temps depuis longtemps sur la transfection ils ont échoué à l'exportation vers la surface. Saito et al ont démontré seule récepteur membranaire passent protéine de transport (RTP) chaperons familiales montrent une expression accrue dans les neurones olfactifs sensoriels et d'agir comme accompagnateur à récepteurs olfactifs du trafic à la surface des cellules hétérologues, en cas de co transfectées ensemble 3. Pour mener à bien des dosages biochimiques des récepteurs utilisant des cellules hétérologues, on doit d'abord déterminer si le récepteur affiche l'expression en surface robuste dans la lignée cellulaire. Cela peut être dosé en surexprimant les récepteurs à la RTP1S chaperon suivie par coloration de cellules vivantes à fluorescence étiquette du domaine extracellulaire ou un tag dans le domaine extracellulaire exclusivement. Ici nous démontrons un protocole pour mener à bien coloration de cellules vivantes qui peuvent être utilisés pour détecter les récepteurs olfactifs à la surface des cellules HEK293T commodément. En outre, il peut également être utilisé pour le dosage de l'expression de surface d'autres récepteurs chimiosensoriels ou RCPG.
Protocole
1. Procédure:
La procédure comprend trois parties réalisé sur une durée totale de 3 jours: les cellules de transfert, la transfection et l'immunocytochimie, une étape menée par jour. Transfert et transfection de cellules au cours des deux premiers jours doit être effectué dans des conditions stériles dans une chambre à flux laminaire.
Jour 1: Transfert de cellules pour le dosage HEK293T expression à la surface.
- Le fluide caloporteur (M10): Mélanger milieu essentiel minimum supplémenté avec 10% (en volume) de sérum bovin fœtal à l'état stérile.
- Cultiver des cellules à une confluence souhaité d....
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Discussion
Chaque étape doit être réalisée avec soin pour s'assurer coloration de surface importante et distinctive. Le processus de coloration au complet doit être effectué à froid (sur glace), et le plateau sur lequel sont fixées des lamelles doit être refroidi avant de l'utiliser pour assurer les cellules rester en vie. Par ailleurs la fixation est effectuée à la fin du processus de coloration de surface. Ceci est en contraste frappant avec la coloration interne où la fixation précède coloration pour perméabiliser la me.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Nous remercions les membres du laboratoire pour Matsunami lecture critique de ce manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Couvre-objet 22 x 22 mm (#1) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 72200-11 | |
| Sérum de veau fœtal | GIBCO, par Life Technologies | 16000 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Milieu minimum essentiel | Sigma-Aldrich | M4655 | Avec L-glutamate, sel d'Earle’s et bicarbonate |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| Paraformaldéhyde | EMS | 19208 | |
| Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) 1X | GIBCO, par Life Technologies | 14025 | Avec chlorure de calcium et chlorure de magnésium |
| Solution tampon HEPES | GIBCO, par Life Technologies | 15630 | |
| Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Sans calcium ni magnésium |
| Hydrobromure de poly-D-lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Azoture de sodium | Electron Microscopy Sciences | SX0299-1 | |
| Plaque de culture de tissus 35 x 10 mm | Falcon BD | 353801 | |
| Trypsine-EDTA | GIBCO, par Life Technologies | 25300 | 0,05 % |
Références
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H.....
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Réimpressions et autorisations
