Summary

Опробование поверхностного Выражение хемосенсорных рецепторов в клетках Гетерологическая

Published: February 23, 2011
doi:

Summary

Здесь показано, протокол проводить окрашивание живой элемент, который может быть использован для обнаружения одоранта рецепторами на поверхности клетки HEK293T удобно. Кроме того, она также может быть использована для анализа на поверхности экспрессию других хемосенсорных рецепторов или GPCRs.

Abstract

Яркий мир запахов признается чувство обоняния. Обоняние у мышей опосредованы репертуаре около 1200 G белком рецепторы (GPCR) 1, которые постулируются для связывания летучих молекул одоранта и преобразования внеклеточного сигнала в внутриклеточного сигнала связи с G белком Gαolf. Связывание одорантов на рецепторы, как полагают, следовать комбинаторной правило, то есть тот, одоранта может связывать несколько рецепторов и одного рецептора может связывать несколько отдушки и в разной степени 2. Биохимические, сигнализации и связывание лигандов исследований было удобно проводить для большинства GPCRs использовании гетерологичной клеток. Однако использование гетерологичной клеток для изучения рецепторов одоранта, была исключена в течение длительного времени, так как на трансфекции им не удалось экспортировать на поверхность. Сайто и др. показали, одного рецептора мембраны проходят Транспортировка белка (RTP) семья сопровождающих шоу повышенной экспрессии в обонятельной сенсорных нейронов и выступают в качестве сопровождающих для движения одоранта рецепторами на поверхности клетки в гетерологичных, когда совместно трансфицированных вместе 3. Для проведения биохимических анализов для рецепторов использовании гетерологичной клетки, нужно сначала определить, если рецептор показывает надежную выражение поверхности клеточной линии. Это может быть проанализированы по гиперэкспрессией рецепторов с сопровождающим RTP1S последующим окрашиванием живой клетки к флуоресцентно этикетке внеклеточного домена или тег в внеклеточный домен исключительно. Здесь показано, протокол проводить окрашивание живой элемент, который может быть использован для обнаружения одоранта рецепторами на поверхности клетки HEK293T удобно. Кроме того, она также может быть использована для анализа на поверхности экспрессию других хемосенсорных рецепторов или GPCRs.

Protocol

1. Порядок действий: Процедура состоит из трех частей завершила более общее время 3-х дней: передача клеток, трансфекции и иммуноцитохимия, один шаг осуществляется в день. Передача и трансфекции клеток в течение первых двух дней должна проводиться в стерильных условиях в к…

Discussion

Каждый шаг должен быть проведена тщательно, чтобы гарантировать известных и отличительные поверхности окрашивания. Весь процесс окрашивания должны выполняться в холодную (на льду), и подносом, на котором крышка скользит проложены должен быть охлажден до использования, чтобы обеспечи?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим членов Мацунами лабораторию для критического чтения этой рукописи.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Cover slip 22 X 22 mm (#1)   Thermo Scientific 72200-11  
Fetal bovine serum   Gibco 16000  
Lipofectamine 2000   Invitrogen 11668-019  
Minimal essential medium   Sigma M4655 With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate
Mowiol   Calbiochem 475904  
Paraformaldehyde   EMS 19208  
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X   Gibco 14025 With calcium chloride and magnesium chloride
HEPES Buffer Solution   Gibco 15630  
Phosphate Buffer Saline (PBS)   Cellgro 21-040-CV Without calcium and magnesium
Poly D Lysine Hydrobromide   Sigma P7280  
Sodium Azide   EM Science SX0299-1  
Tissue culture dish 35 X 10 mm   Falcon 353801  
Trypsin-EDTA   Gibco 25300 0.05%

References

  1. Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
  2. Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
  3. Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
  4. Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).

Play Video

Cite This Article
Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. Assaying Surface Expression of Chemosensory Receptors in Heterologous Cells. J. Vis. Exp. (48), e2405, doi:10.3791/2405 (2011).

View Video