Märkning F-aktin Barbed Slutar med Rhodamine-aktin i Permeabilized Neuronal Tillväxt Kottar
Summary
En metod att visualisera och kvantifiera F-aktin taggtråd slutar i neuronala tillväxt kottar beskrivs. Efter odling nervceller på glas täckglas, celler permeabilized med en saponin-innehållande lösning. Sedan innehåller en kort inkubation med saponin buffert innehållande Rhodamine-aktin fluorescerande aktin på fri aktin hullingar slutar.
Abstract
Den rörliga tips av växande axoner kallas tillväxt kottar. Tillväxt kottar leda navigera axoner genom att utveckla vävnader genom att interagera med lokalt uttryck molekylära vägledning ledtrådar som binder receptorer tillväxt konen och reglera dynamiken och organisationen av tillväxten konen cytoskelettet 3-6. Det huvudsakliga målet för dessa navigations-signaler är aktin filament meshwork som fyller i periferin tillväxt konen och som driver tillväxten konen motilitet genom ständig aktin polymerisation och dynamiska remodeling 7. Positivt eller attraktiva vägledning cues inducerar tillväxt kotte vrida genom att stimulera aktin filament (F-aktin) polymerisation i regionen av tillväxten konen periferin som är närmast källan till lockbete kö. Detta aktin polymerisation driver lokal tillväxt kotte utstick, vidhäftning av de ledande marginal och axonal töjning mot lockmedel.
Aktin filament polymerisation beror på tillgången av tillräckliga aktin monomer och polymerisation atomkärnor eller aktin filament hullingförsedda slutar för tillsättning av monomer. Actin monomer finns i överflöd i chick retinal och dorsala ganglion (DRG) tillväxt kottar. Följaktligen ökar polymerisation snabbt när fri F-aktin taggtråd slutar blir tillgängliga för monomer tillägg. Detta sker i chick DRG och retinal kottar tillväxt via de lokala aktivering av F-aktin bryta proteinet aktin depolymerizing faktor (ADF / cofilin) i tillväxten konen regionen närmare ett lockmedel 8-10. Denna förhöjda ADF / cofilin aktivitet bryter aktin filament för att skapa nya F-aktin taggtråd ändar för polymerisation. Följande metod visar denna mekanism. Totala innehållet av F-aktin är synliga genom färgning med fluorescerande phalloidin. F-aktin taggtråd ändar synliga genom införlivandet av Rhodamine-aktin inom tillväxtområden koner som är permeabilized med det förfarande som beskrivs i följande, som är anpassad från tidigare studier av andra rörliga celler 11, 12. När Rhodamine-aktin läggs vid en koncentration över den kritiska koncentrationen för aktin monomerer Förutom taggtråd ändar, monterar Rhodamine-aktin på fri hullingar slutar. Om attraktiva Cue presenteras i en lutning, som släpps från en mikropipett placerad på ena sidan av en tillväxt kon, kommer införlivandet av Rhodamine-aktin på F-aktin taggtråd slutar vara större i tillväxten konen sidan mot mikropipetten 10 .
Tillväxt kottar är små och ömtåliga cellstrukturer. Förfarandena i permeabilization, Rhodamine-aktin bolagsordning, fixering och fluorescens visualisering är alla omsorgsfullt gjort och kan utföras på scenen av ett inverterat mikroskop. Dessa metoder kan tillämpas för att studera lokala aktin polymerisation i migrerar nervceller, andra primära celler vävnad eller cellinjer.
Protocol
Discussion
De metoder som presenteras här kan tidsmässiga och rumsliga upplösningen i cellulära komponenter som ingår i den dynamiska ombyggnaden av aktin cytoskelettet på ledande marginalen att migrera tillväxt kottar. Den handling av lockbete molekyler, såsom NGF eller netrin, att snabbt stimulera aktin filament polymerisation avslöjas som en lokal ökning av aktin taggtråd slutar, skapad av aktin filament bryta av aktivt ADF / cofilin 10, som visas i figur 1 och 2. Metoden möjliggör lokalisering av andra …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Dr James Bamburg och medlemmar av hans laboratorium för samverkan i dessa studier. Detta arbete har finansierats av NIH bidrag HD19950, EY07133 och med bidrag från Minnesota Medical Foundation.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 18×18 mm coverslip | Gold Seal | 3305 | ||
| 35mm Petri dishes | Falcon | 351008 | ||
| Aquarium cement | DAP 100% silicone aquarium sealant | Any hardware store | ||
| Poly-D-lysine (mw > 300,000) | Sigma | P1024 | ||
| Natural mouse laminin | Invitrogen | 23017-015 | ||
| L1 CAM | R & D systems | 777-NC | ||
| Alexa-fluor 350 phalloidin | Invitrogen (Molecular Probes) | A22281 | ||
| Rhodamine non-muscle actin | Cytoskeleton, Inc. | APHR-A | ||
| F12 Culture medium | Invitrogen (Gibco) | 21700-075 | ||
| B27 | Invitrogen (Gibco) | 17504-044 | ||
| Slowfade | Invitrogen | 536937 |
References
- Lowery, L. A., Van Vactor, D. The trip of the tip: Understanding the growth cone machinery. Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 332-343 (2009).
- Letourneau, P., Squire, L. R. Axonal Pathfinding: Extracellular Matrix Role. Encyclopedia of Neuroscience. , 1139-1145 (2008).
- Kalil, K., Dent, E. W. Touch and go: Guidance cues signal to the growth cone cytoskeleton. Curr Opin Neurobio. 15, 521-526 (2005).
- Dent, E. W., Gertler, F. B. Cytoskeletal dynamics and transport in growth cone motility and axon guidance. Neuron. 40, 209-227 (2003).
- Pak, C. W., Flynn, K. C., Bamburg, J. R. Actin-binding proteins take the reins in growth cones. Nat Rev Neurosci. 9, 136-147 (2008).
- Guan, K. L., Rao, Y. Signaling mechanisms mediating neuronal responses to guidance cues. Nat Rev Neurosci. 4, 941-956 (2003).
- Gallo, G., Letourneau, P. C. Regulation of growth cone actin filaments by guidance cues. J. Neurobiology. 58, 92-102 (2004).
- Fass, J., Gehler, S., Sarmiere, P., Letourneau, P., Bamburg, J. R. Regulating filopodial dynamics through actin-depolymerizing factor/cofilin. Anat Sci Inter. 79, 173-183 (2004).
- Bernstein, B. W., Bamburg, J. R. ADF/cofilin: A functional node in cell biology. Trends Cell Biol. 20, 187-195 (2010).
- Marsick, B. M., Flynn, K. C., Santiago, M., Bamburg, J. R., Letourneau, P. C. Activation of ADF/cofilin mediates attractive growth cone turning toward nerve growth factor and netrin-1. Dev Neurobiol. 70, 565-588 (2010).
- Symons, M. H., Mitchison, T. J. Control of actin polymerization in live and permeabilized fibroblasts. J Cell Biol. 114, 503-513 (1991).
- Chan, A. Y., Raft, S., Bailly, M., Wyckoff, J. B., Segall, J. E., Condeelis, J. S. EGF stimulates an increase in actin nucleation and filament number at the leading edge of the lamellipod in mammary adenocarcinoma cells. J Cell Sci. 111, 199-211 (1998).
