Saponina permeabilizadas preparação de fibras em conjunto com a análise de fosforilação oxidativa fornece respirométrico de avaliação integrada da função mitocondrial. Respiração mitocondrial em estados fisiológicos e patológicos pode refletir várias influências regulamentares, incluindo as interações mitocondrial, morfologia e bioquímica.
Investigação da função mitocondrial representa um parâmetro importante da fisiologia cardíaca, como as mitocôndrias estão envolvidas no metabolismo energético, estresse oxidativo, apoptose, envelhecimento, Encefalomiopatias mitocondriais e toxicidade de drogas. Diante disso, tecnologias para medir a função mitocondrial cardíaca estão na demanda. Uma técnica que emprega uma abordagem integrativa para medir a função mitocondrial é respirométrico fosforilação oxidativa análise (OXPHOS).
O princípio da avaliação OXPHOS respirométrico é centrado em torno de medir a concentração de oxigênio utilizando um eletrodo de Clark. À medida que o feixe de fibras permeabilizadas consome oxigênio a concentração de oxigênio, no declínio câmara fechada. Usando protocolos selecionados substrato inibidor desacoplador-titulação, os elétrons são fornecidos para sites específicos da cadeia de transporte de elétrons, permitindo a avaliação da função mitocondrial. Antes da análise da função mitocondrial respirométrico, mecânica e química técnicas de preparação são utilizados para permeabilizar o sarcolema das fibras musculares. Permeabilização química emprega saponina para seletivamente perfurar a membrana celular, mantendo a arquitetura celular.
Este artigo descreve minuciosamente os passos envolvidos na preparação saponina de pele fibras cardíacas para medições de consumo de oxigênio para avaliar OXPHOS mitocondrial. Além disso, solução de problemas conselhos, bem como substratos específicos, inibidores e desacopladores que podem ser usados para determinar a função da mitocôndria em locais específicos da cadeia de transporte de elétrons são fornecidos. Importante, o protocolo descrito podem ser facilmente aplicadas ao tecido cardíaco e esquelético de vários modelos animais e amostras humanas.
A saponina técnica das fibras cardíacas permeabilizadas oferece um compromisso único entre in vitro e in vivo de avaliação do consumo de oxigênio mitocondrial OXPHOS. Vantagens desta técnica incluem o aumento da relevância fisiológica em comparação com mitocôndrias isoladas como arquitetura celular é preservada. Enquanto a membrana plasmática é degradado, as estruturas de membrana intracelular, incluindo 12 mitocôndrias, 14, retículo sarcoplasmático 14, miofilame…
The authors have nothing to disclose.
Este estudo foi financiado pelos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde e Canadá Genoma. JS realiza premiação salário apoio da Heritage Foundation Alberta para a investigação médica, Heart and Stroke Foundation of Canada e da Associação de Diabetes do Canadá. O laboratório gostaria de agradecer a assistência técnica de instrumentos Oroboros durante a aquisição da técnica de fibra saponina permeabilizadas.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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100% Ethanol | Fisher Scientific | HC600 | ||
70% Ethanol | Fisher Scientific | HC-1000 | ||
Adenosine 5′-diphosphate monopotassium salt dihydrate (ADP) | Sigma | A5285 | ||
Albumin from bovine serum essentially fatty acid–free | Sigma | A-6003 | ||
Antimycin A | Sigma | A8674 | ||
Ascobic acid | Sigma | A4403 | ||
Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A2383 | ||
Atractyloside | Sigma | A6882 | ||
Calcium carbonate | Sigma | C4830 | ||
Carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | ||
Cytochrome c | Sigma | C7752 | ||
Digitonin | Sigma | D141 | ||
Dithiothreitol | Sigma | D9779 | ||
Ethylene glycol-bis-(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E4378 | ||
Glutamic acid | Sigma | 27647 | ||
HEPES | Sigma | H4034 | ||
Imidazole | Sigma | I5513 | ||
Ketamine | Pfizer | Ketaset | ||
Lactobionic acid | Sigma | 153516 | ||
Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma | M9272 | ||
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2∙6H2O) | Sigma | M9272 | ||
Malic acid | Sigma | M1000 | ||
MES | Sigma | M3671 | ||
N,N,N’,N’-Tetramethyl- pphenylenediamine Dihydrochloride (TMPD) | Sigma | T3134 | ||
Oligomycin | Sigma | O4876 | ||
Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ||
Potassium Chloride | Sigma | P9541 | ||
Potassium Hydroxide | Sigma | P5958 | ||
Potassium cyanide | Fluka | 60178 | ||
Potassium phosphate monobasic | Sigma | P5655 | ||
Rotenone | Sigma | R8875 | ||
Saponin | Sigma | 47036 | ||
Sodium Pentobarbital | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54.7 mg/ml | |
Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | ||
Succinic acid | Sigma | S3674 | ||
Sucrose | Sigma | S7903 | ||
Taurine | Sigma | T8691 | ||
Xylazine | Bayer | Rompun | ||
ddH2O | ||||
Ice | ||||
Oroboros Oxygraph-2k | Oroboros Instruments | |||
Kimwipes | VWR | 21905-026 | ||
15ml polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89004-368 | ||
50ml polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89004-364 | ||
Straight Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-50B | ||
Curved Jewelers Forceps | George Tiemann & Co. | 160-57B | ||
Straight Surgery Scissors | George Tiemann & Co. | 105-402 | ||
Sterile Surgical Blade | VWR | BD371610 | ||
0.45-μm Syringe filters | VWR | CA28145-485 | ||
pH meter | VWR | CA11388-308 | ||
Glass Petri dishes | VWR | 89000-300 | ||
12-well Polystyrene Tissue Culture Plates | VWR | 82050-926 | ||
Plate Stirrer | VWR | 97042-594 | ||
Fisherbrand Microbars | Fisher Scientific | 14-511-67 | ||
Weigh Scale | VWR | CA11278-162 | ||
10μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-815-1 | ||
25μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-7 | ||
50μl Hamilton Micro Syringe | Fisher Scientific | 14-824-5 | ||
Nalgene Squeeze Bottles | Wilkem Scientific | LNA2407-1000 | ||
Polystyrene Weighing Dishes | VWR | 89106-750 | ||
Dissecting Microscope | Olympus |