Hyperinsulinemic-Euglycemic Clamp i det medvetna Rat
Summary
Den hyperinsulinemic-euglycemic klämman är den "gyllene standard" för bedömning av insulin åtgärder. Insulin är infunderas med en konstant hastighet stimulerande glukosupptag. Mängden av exogena infunderad glukos för att motverka denna minskning är ett tecken på insulinkänslighet. Här proceduren utförs på ett medvetet, otyglad råtta.
Abstract
Typ 2 diabetes (T2D) är snabbt stigande i prevalens. Kännetecknas av antingen otillräcklig insulinproduktion eller oförmåga att använda insulin som produceras, T2D resulterar i förhöjda blodsockernivåer. Den "gyllene standard" för att bedöma känsligheten för insulin är ett hyperinsulinemic-euglycemic klämma eller insulin klämma. Vid detta förfarande är insulin infusion med en konstant hastighet vilket resulterar i en sänkning av blodsockret. För att bibehålla blodsockret på en konstant nivå, är exogent glukos (D50) infunderas i venösa cirkulationen. Mängden infunderad glukos för att upprätthålla homeostas är ett tecken på insulinkänslighet. Här visar vi de grundläggande klämman förfarandet i kroniskt kateter, ohämmad, medveten råtta. Denna modell gör att blodet samlas in med minimal stress för djuret. Efter induktion av anestesi, är ett mittlinjen snitt och vänster gemensamma halspulsådern och höger halspulsåder är kateter. Infogade katetrar spolas med hepariniserat saltlösning, sedan exteriorized och säkras. Djur är tillåtna att återhämta sig i 4-5 dagar före experiment, med viktökning kontrolleras dagligen. Endast de djur som går upp vikt innan operation nivåer används för experiment. På dagen av försöket, är råttor fastade och ansluts till pumpar som innehåller insulin och D50. Baseline glukos bedöms i arteriell linje och använt ett riktmärke under hela försöksperioden (euglycemia). Efter detta är insulin infusion med en konstant hastighet i den venösa cirkulationen. För att matcha nedgången i blodsockret, är D50 infunderas. Om graden av D50 infusion är större än graden av upptag, kommer en ökning av glukos förekommer. Likaså om räntan är otillräcklig för att matcha hela upptaget kroppen glukos, kommer en droppe inträffa. Titrering av glukos fortsätter tills stabila glukosvärden uppnås. Glukosnivåer och glukos infusionshastigheter under denna stabila period registreras och rapporteras. Resultaten ger ett index på hela kroppen insulinkänslighet. Tekniken kan förfinas för att möta specifika experimentella krav. Det förstärks ytterligare genom användning av radioaktiva spårämnen som kan avgöra vävnad specifika insulin stimuleras upptaget av glukos samt hela kroppen glukos omsättning.
Protocol
Discussion
Ursprungligen utvecklats för utredning av insulinkänsligheten hos människor, har klämman förfarande nu anpassas till andra arter, inklusive laboratorie råttor och möss. Undersöka djurmodeller av insulinresistens ger ett betydande stöd för att förstå patofysiologin vid insulinkänslighet och därmed sammanhängande sjukdomar samt att identifiera terapeutiska åtgärder som har kliniskt värde 1,2. Flera metoder för att utvärdera insulinkänsligheten hos djur har varit anställd 3. Såd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av den kanadensiska Institutes of Health Research och Genome Canada.JS håller utmärkelser lön stöd från Alberta Heritage Foundationfor medicinsk forskning, Hjärt-och Stroke Foundation Canadaand den kanadensiska Diabetes Association. Speciellt tack till Dr David Wasserman och Bingle Bracy för undervisning detta förfarande till Shearer laboratoriet.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Intramedic Polyethylene Tubing (PE-50) | Fisher Scientific | 14-170-12B | Internal diameter of .58mm (.023″) x Outer diameter of .965mm (.038″) |
| Dow Corning Silastic Laboratory Tubing | Fisher Scientific | 11-189-15C | Internal diameter of .76mm (0.030″) x Outer diameter of 1.65mm (0.065″) |
| Tygon S-50-HL Medical Tubing | Harvard Apparatus | PY2 72-1251 | Internal diameter of 3.2mm (0.125″) x Outer diameter of 4.7mm (0.1875″) |
| Loctite Super Glue | Grand & Toy | 32237 | Gel Control |
| Sterile Surgical Blade | VWR | BD371610 | |
| Curved Micro Dissecting Forceps | George Tiemann & Co. | 160-20 | x 2 |
| Straight Micro Dissecting Forceps | George Tiemann & Co. | 160-15 | x 2 |
| Curved Hemostat | George Tiemann & Co. | 105-1135 | x 2 |
| Straight Hemostat | George Tiemann & Co. | 105-1130 | x 2 |
| Hemostat Tip Guards | Robbins Instruments, Inc. | 15.09-2-004 | |
| Straight Surgery Scissors | George Tiemann & Co. | 105-402 | |
| VENOJECT Multi-Sample Luer Adapter | Terumo Medical Products | 810127A | 21 guage, 1 in. |
| Sterile Catheter Introducer | Becton Dickinson | 406999 | |
| 14-gauge Blunt Needle | Becton Dickinson | 511310 | 14 guage, 2 in. |
| Sterile Surgical Suture | Johnson & Johnson Medical Products | 1679H | Silk, size 3-0 |
| Non-Sterile Surgical Suture | Angiotech Pharmaceuticals, Inc. | SP116 | Silk, size 4-0 |
| Cotton Swabs | VWR | 10806-005 | |
| 4ply Gauze Pads | VWR | CA43845-062 | |
| Small Animal Cordless Clippers | Harvard Apparatus | 729063 | |
| Isoflurane | Halocarbon Products Corp. | IPN-45 | |
| Anesthetic Cart | Benson Medical Industries, Inc. | ||
| 70 % Ethanol | Fisher Scientific | HC-1000 | |
| Betadine Antiseptic Solution | Western Drug Distribution Centre Ltd. | 105267 | |
| Model 11 Plus Syringe Pump | Harvard Apparatus | 702208 | |
| Stainless Steel Tubing Couplers | Harvard Apparatus | 72-4434 | 23 gauge, 0.3 in. |
| Stainless Steel Tubing Plugs | Harvard Apparatus | 72-4436 | 23 gauge, 0.5 in. |
| Stainless Steel Blunt Needles | Instech Laboratories, Inc. | LS22 | 22 gauge |
| 60 Degree Y-Connectors | Small Parts | STCY-22-05 | 22 gauge |
| CritSpin Micro-hematocrit Centrifuge | Iris Sample Processing | CS12 | |
| Mini Centrifuge | Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Micro Centrifuge Tubes | VWR | 53550-778 | |
| 50ml polypropylene centrifuge tubes | VWR | 89004-364 | |
| 1ml Plastic Slip Tip Syringes | Becton Dickinson | 309602 | |
| 3ml Plastic Luerlok Tip Syringes | Becton Dickinson | 309585 | |
| Heparin Anticoagulant Injection | Western Drug Distribution Centre Ltd. | 102824 | Manufacturer: LEO Pharma Inc. Conc. 1000 IU |
| EDTA Solution | Promega Corp. | V4231 | 0.5 M, pH 8.0 |
| Saline | Western Drug Distribution Centre Ltd. | ABB7983154 | Manufacturer: Hospira 0.9% Sodium Chloride |
| 50% Dextrose | Vetoquinol | 8DEX012D | |
| Humulin-R | Eli Lilly | HI-210 | 100U/ml |
| 1ml Insulin Syringes | Becton Dickinson | 309311 | |
| Fisherbrand* Hemato-Seal Sealant | Fisher Scientific | 02-678 | |
| Fisherbrand* Microhematocrit Capillary Tubes | Fisher Scientific | 22-362-574 | |
| One Touch Ultra Test Strips | LifeScan, Inc. | AW 085-314H | |
| One Touch Ultra Blood Glucose Meter | LifeScan, Inc. | AW 085-314B | |
| Sodium Pentobarbitol | Ceva Sante Animale | 1715 138 | Conc. 54.7mg/ml |
| Red Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-932 | |
| Blue Laboratory Labeling Tape | VWR | 89097-936 | |
| Weigh Scale | Fisher Scientific | 01-913-88 | |
| Vortex | VWR | 58815-234 | |
| Timer | VWR | 62344-641 |
References
- Halseth, A. E., Bracy, D. P., Wasserman, D. H. Limitations to basal and insulin-stimulated skeletal muscle glucose uptake in the high-fat-fed rat. Am J Physiol Endocrinol Metab. 279, E1064-E1071 (2000).
- Halseth, A. E., Bracy, D. P., Wasserman, D. H. Limitations to muscle glucose uptake due to high fat feeding. Am. J. Physiol. 279, E1064-E1071 (2000).
- Muniyappa, R., Lee, S., Chen, H., Quon, M. J. Current approaches for assessing insulin sensitivity and resistance in vivo: advantages, limitations, and appropriate usage. Am J Physiol Endocrinol Metab. 294, 15-26 (2008).
- Cho, H. Insulin resistance and a diabetes mellitus-like syndrome in mice lacking the protein kinase Akt2 (PKB beta). Science. 292, 1728-1731 (2001).
- Dubois, M. J. The SHP-1 protein tyrosine phosphatase negatively modulates glucose homeostasis. Nat Med. 12, 549-556 (2006).
- Pacini, G., Thomaseth, K., Ahren, B. Contribution to glucose tolerance of insulin-independent vs. insulin-dependent mechanisms in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 281, 693-703 (2001).
- Herbach, N. Dominant-negative effects of a novel mutated Ins2 allele causes early-onset diabetes and severe beta-cell loss in Munich Ins2C95S mutant mice. Diabetes. 56, 1268-1276 (2007).
- Maeda, N. Diet-induced insulin resistance in mice lacking adiponectin/ACRP30. Nat Med. 8, 731-737 (2002).
- Potenza, M. A., Marasciulo, F. L., Tarquinio, M., Quon, M. J., Montagnani, M. Treatment of spontaneously hypertensive rats with rosiglitazone and/or enalapril restores balance between vasodilator and vasoconstrictor actions of insulin with simultaneous improvement in hypertension and insulin resistance. Diabetes. 55, 3594-3603 (2006).
- Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55, 390-397 (2006).
- Wasserman, D. H., Ayala, J. E., McGuinness, O. P. Lost in translation. Diabetes. 58, 1947-1950 (2009).
