कार्यात्मक मैट्रिक्स Metalloproteinases के Zymography द्वारा जांच
Summary
इस प्रोटोकॉल संस्कृति supernatants या शरीर के तरल पदार्थ में मैट्रिक्स metalloproteinases का पता लगाने के लिए एक गतिविधि आधारित परख का वर्णन करता है.
Abstract
Matrix metalloproteinases (MMPs) are zinc-containing endopeptidases. They degrade proteins by cleavage of peptide bonds. More than twenty MMPs have been identified and are separated into six groups based on their structure and substrate specificity (collagenases, gelatinases, membrane type [MT-MMP], stromelysins, matrilysins, and others). MMPs play a critical role in cell invasion, cartilage degradation, tissue remodeling, wound healing, and embryogenesis. They therefore participate in both normal processes and in the pathogenesis of many diseases, such as rheumatoid arthritis, cancer, or chronic obstructive pulmonary disease1-6. Here, we will focus on MMP-2 (gelatinase A, type IV collagenase), a widely expressed MMP. We will demonstrate how to detect MMP-2 in cell culture supernatants by zymography, a commonly used, simple, and yet very sensitive technique first described in 1980 by C. Heussen and E.B. Dowdle7-10. This technique is semi-quantitative, it can therefore be used to determine MMP levels in test samples when known concentrations of recombinant MMP are loaded on the same gel11.
Solutions containing MMPs (e.g. cell culture supernatants, urine, or serum) are loaded onto a polyacrylamide gel containing sodium dodecyl sulfate (SDS; to linearize the proteins) and gelatin (substrate for MMP-2). The sample buffer is designed to increase sample viscosity (to facilitate gel loading), provide a tracking dye (bromophenol blue; to monitor sample migration), provide denaturing molecules (to linearize proteins), and control the pH of the sample. Proteins are then allowed to migrate under an electric current in a running buffer designed to provide a constant migration rate. The distance of migration is inversely correlated with the molecular weight of the protein (small proteins move faster through the gel than large proteins do and therefore migrate further down the gel). After migration, the gel is placed in a renaturing buffer to allow proteins to regain their tertiary structure, necessary for enzymatic activity. The gel is then placed in a developing buffer designed to allow the protease to digest its substrate. The developing buffer also contains p-aminophenylmercuric acetate (APMA) to activate the non-proteolytic pro-MMPs into active MMPs. The next step consists of staining the substrate (gelatin in our example). After washing the excess dye off the gel, areas of protease digestion appear as clear bands. The clearer the band, the more concentrated the protease it contains. Band staining intensity can then be determined by densitometry, using a software such as ImageJ, allowing for sample comparison.
Protocol
Discussion
हमने दिखा दिया है कि कैसे सेल संस्कृति supernatants में MMP-2 के zymographic विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए.
नमूने की राशि के लिए एक जेल पर लोड empirically मूल और ब्याज की एमएमपी के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए. भी थोड़ा पता लगाने को रोकने जबकि बहुत ज्यादा लोड हो रहा है लोड हो रहा है संतृप्ति के लिए नेतृत्व के रूप में वहाँ केवल इतना सब्सट्रेट एक protease बैंड के क्षेत्र में पचा सकता है हो सकता है. यदि आवश्यक हो, तो नमूना विआयनीकृत जल में बफर लोड हो रहा है या समय के विकास के साथ मिश्रण करने से पहले पतला होना कर सकते हैं डे रातोंरात से 4 घंटे के लिए कम किया जा सकता. यह भी संभव है concentrators (जैसे Millipore सूची UFC803024 #) का उपयोग कर समाधान में प्रोटीन ध्यान केंद्रित है. यदि बैंड मुश्किल से दिखाई रहते हैं, यह जैल के लिए समय की एक लंबी अवधि के लिए विकसित करने के लिए आवश्यक हो सकता है, भी 48 घंटे तक हो सकता है. जब टिशू कल्चर supernatants से नमूने की तैयारी, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि भ्रूण गोजातीय सीरम (और अन्य सीरा) एम एम पी है कि परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं शामिल होना चाहिए. इस कारण से, हम सीरम मुक्त माध्यम में संस्कृति के बाद हमारे supernatants के सभी एकत्र.
2.9 प्रोटोकॉल के पैराग्राफ और 2.10 में वर्णित washes पचा बैंड की धुंधला पृष्ठभूमि को दूर करने के लिए आवश्यक हैं. लंबा धोने गुना अधिक पृष्ठभूमि निकालने के लिए, लेकिन यह भी मंद होगा जेल भर सब्सट्रेट के धुंधला हो जाना. यदि अब धोने बार जरूरी हैं, हम जेल हर कुछ घंटों स्कैनिंग की सिफारिश के लिए सबसे अच्छा विपरीत के साथ स्कैन का चयन करें.
इस तकनीक को अन्य एम एम पी का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए,-9 एमएमपी जिलेटिन जैल पर पाया जा सकता है, और यह भी एक कम हद एमएमपी-1, एमएमपी-8, और एमएमपी-13 के रूप में जिलेटिन अपने पसंदीदा सब्सट्रेट नहीं है. MMP-1 और MMP-13 कोलेजन zymography पर सबसे अच्छा पता चला रहे हैं, जबकि कैसिइन एमएमपी-11 के लिए पसंदीदा सब्सट्रेट है और यह भी पता लगाने MMP-1 के, एमएमपी-3, एमएमपी-7, एमएमपी-12, और एमएमपी-13 के लिए अनुमति देता है 9. एमएमपी 7 (matrilysin) और collagenases (एमएमपी-1 और MMP-13) का पता लगाने जब कैसिइन या जिलेटिन जैल में कम स्तर पर मौजूद करने के लिए मुश्किल हैं. हेपरिन की जेल लोडिंग के समय में नमूना के अलावा काफी एमएमपी-7 के लिए पता लगाने की सीमा में सुधार. MMP-1 और MMP-13 के लिए, हेपरिन जेल करने के लिए जोड़ा जा electrophoretic रन के बाद 12 तरह के तहत पहले से ही है की जरूरत है.
चूंकि zymography और एंजाइमों के विकृतीकरण renaturation बाद enzymatic गतिविधि के उपाय, यह सभी नमूने में मौजूद एम एम पी की गतिविधि उपाय करेंगे. यह एंजाइमों, समर्थक एंजाइमों, और अंतर्जात inhibitors (जैसे TIMP-2) करने के लिए बाध्य एंजाइमों शामिल हैं. लेकिन यह संभव है के लिए सक्रिय एंजाइम बैंड के घनत्व की तुलना द्वारा और समर्थक एंजाइम है, जो एक थोड़ा उच्च आणविक भार होगा कि नमूने में एमएमपी सक्रियण के स्तर को निर्धारित है.
Zymography अक्सर एक एमएमपी की पहचान करने के लिए पर्याप्त नहीं है. ज्ञात आणविक भार मानकों के साथ एक एमएमपी के प्रवास के स्तर की तुलना की पहचान में मदद करता है, लेकिन यह नोट किया जाना चाहिए कि इन मानकों में से कुछ एक को कम करने के एजेंट होते हैं और जब गैर को कम करने की शर्तों के तहत प्रयोग किया जाता है वे अलग आणविक भार 9 का संकेत हो सकता है कि है. एक विकल्प के लिए परीक्षण के नमूने के रूप में एक ही जेल पर एक घुलनशील पुनः संयोजक एमएमपी लोड है. एम एम पी लेकिन अन्य प्रोटीन के साथ जुड़ा हो सकता है स्पष्ट आणविक भार में परिवर्तन उत्प्रेरण. चयनात्मक एमएमपी inhibitors औषधीय उपकरण के रूप में विकासशील बफर में ऊष्मायन के दौरान (या आधे में एक जेल में कटौती का हिस्सा) की पहचान के लिए जेल के लिए जोड़ा जा सकता है interest.A दूसरी तकनीक (वेस्टर्न ब्लाट immunocytochemistry, या एलिसा) के एमएमपी के लिए सिफारिश की है ब्याज की एमएमपी की पहचान में मदद करते हैं. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि पश्चिमी blots पता लगाने के लिए सीमा अक्सर zymographic जैल के उन लोगों की तुलना में बहुत कम है, संभावित झूठी नकारात्मक परिणामों के लिए अग्रणी जब इस तकनीक का उपयोग करना चाहिए.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम प्रोटीन concentrators के उपयोग का सुझाव करने के लिए सेल संस्कृति supernatants में एम एम पी की एकाग्रता में वृद्धि करने के लिए डॉ. एस Ressler (आण्विक और सेलुलर जीवविज्ञान विभाग, चिकित्सा Baylor कॉलेज) को धन्यवाद देना चाहूंगा.
इस परियोजना श्रीमती क्लिफर्ड बड़ी व्हाइट ग्राहम संपन्न रिसर्च फंड और NIH / सीबी NIAMS (AR059838) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और करता एनआईएच की आधिकारिक दृश्य जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व करते हैं.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Xcell SureLock Mini-Cell CE mark electrophoresis apparatus | Invitrogen | EI0001 | ||
| Power supply (model 302) | VWR | 93000-744 | ||
| Novex 10% gelatin zymogram gels, 1.0 mm, 12 wells | Invitrogen | EC61752BOX | ||
| Blue Juice gel loading buffer | Invitrogen | 10816015 | ||
| Gel loading tips | VWR | 53509-015 | ||
| Protein molecular weight standard | Invitrogen | LC5800 | ||
| Novex Tris-Glycine-SDS running buffer | Invitrogen | LC2675 | ||
| Novex zymogram renaturing buffer | Invitrogen | LC2670 | ||
| Novex zymogram developing buffer | Invitrogen | LC2671 | ||
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | ||
| Epson Perfection 4490 Photo Scanner | Amazon | n/a | ||
| ImageJ software | http://rsbweb.nih.gov/ij/ | n/a | Authored by W. Rasband, NIH/NIMH |
References
- Luo, J. The role of matrix metalloproteinases in the morphogenesis of the cerebellar cortex. Cerebellum. 4, 239-245 (2005).
- Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors – diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
- Kessenbrock, K., Plaks, V., Werb, Z. Matrix metalloproteinases: regulators of the tumor microenvironment. Cell. 141, 52-67 (2010).
- Lagente, V., Boichot, E. Role of matrix metallopreoteinases in the inflammatory process of respiratory diseases. J. Mol. Cell. Cardiol. 48, 440-444 (2010).
- Rodríguez, D., Morrison, C. J., Overall, C. M. Matrix metallopreoteinases: what do they not do? New substrates and biological roles identified by murine models and proteomics. Biochim. Biophys. Acta. 1803, 39-54 (2010).
- Bourboulia, D., Stetler-Stevenson, W. G. Matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs): positive and negative regulators in tumor cell adhesion. Semin. Cancer Biol. , (2010).
- Heussen, C., Dowdle, E. B. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Analytical Biochem. , 102-196 (1980).
- Lombard, C., Saulnier, J., Wallach, J. Assays of matrix metalloproteinases (MMPs) activities: a review. Biochimie. 87, 265-272 (2005).
- Snoek-van Beurden, P. A., Von den Hoff, J. W. Zymographic techniques for the analysis of matrix metalloproteinases and their inhibitors. Biotechniques. 38, 73-83 (2005).
- Kupai, K., Szucs, G., Cseh, S., Hajdu, I., Csonka, C., Csont, T., Ferdinandy, P. Matrix metalloproteinase activity assays: importance of zymography. J. Pharmacol. Toxicol. Methods. 61, 205-209 (2010).
- Kleiner, D. E., Stetler-Stevenson, W. G. Quantitative zymography: detection of pictogram quantities of gelatinases. Anal. Biochem. 218, 325-329 (1994).
- Yu, W. H., Woessner, J. F. Heparin-enhanced zymographic detection of matrilysin and collagenases. Anal. Biochem. 293, 38-42 (2001).
