Mitokondriell Isolering från skelettmuskulatur
Summary
Detta protokoll beskriver en procedur för att studera andning i mitokondrier isolerade från skelettmuskulaturen. Denna metod anpassades från Scorrano<em> Et al.</em> (2007). Den mitokondriella Isoleringsförfarande kräver ca 2 timmar. Den mitokondriella andning kan fyllas i ca 1 timme.
Abstract
Mitokondrierna är organeller som styr liv och död i cellen. De deltar i viktiga metaboliska reaktioner, syntetisera de flesta av ATP, och reglerar en rad signalering kaskader 2,3. Tidigare och nuvarande forskare har isolerat mitokondrier från råttor och möss vävnader som lever, hjärna och hjärta 4,5. Under senare år har många forskare fokuserat på att studera mitokondriernas funktion från skelettmuskulaturen.
Här beskriver vi en metod som vi har med framgång använts för isolering av mitokondrier från skelettmuskulatur 6. Vårt förfarande kräver att alla buffertar och reagens görs fräscha och behöver ungefär 250-500 mg skelettmuskulaturen. Vi studerade mitokondrierna isolerade från råtta och mus gastrocnemius och mellangärde, och råtta muskler extraocular. Mitokondriell Proteinhalten mäts med Bradford analysen. Det är viktigt att mitokondrie-prover förvaras iskall under beredning och att funktionella studier utförs inom en relativt kort tid (~ 1 tim). Mitokondriell andning mäts med polarography med en Clark-typ elektrod (Oxygraph systemet) vid 37 ° C 7. Kalibrering av syre elektrod är ett viktigt steg i detta protokoll och det måste utföras dagligen. Isolerade mitokondrier (150 mikrogram) tillsätts 0,5 ml av experimentella buffert (EB). Statligt 2 andning börjar med tillägg av glutamat (5mm) och malat (2,5 mm). Då är adenosindifosfat (ADP) (150 M) läggas att starta tillstånd 3. Oligomycinkänslig (1 M), ett ATPas syntas blockerare, används för att uppskatta status 4. Slutligen karbonyl cyanid p-[trifluoromethoxy]-fenyl-hydrazon (FCCP, 0,2 M) läggs till measurestate 5, eller icke-kopplade andning 6. Den respiratoriska kontrollen (RCR), förhållandet mellan staten 3 till status 4, beräknas efter varje försök. En RCR ≥ 4 anses som bevis på en fungerande mitokondrier beredning.
Sammanfattningsvis presenterar vi en metod för isolering av livskraftiga mitokondrier från muskler som kan användas i biokemiska (t.ex. enzymaktivitet, immunodetection, proteomik) och funktionella studier (mitokondriell andning).
Protocol
Discussion
Vi presenterar ett protokoll för att isolera livskraftiga mitokondrier från skelettmuskulaturen. Om avkastningen är ett problem, kan protokollet ändras genom inkubering av isolerade muskler i 5 ml PBS/10mM EDTA/0.01% trypsin i 30 minuter i is. För att garantera komplett muskel uppslutning med trypsin, måste muskeln vara helt malet. Efter 30-minuters inkubation, måste PBS/10mM EDTA/0.01% trypsin lösningen vara helt ersättas med 3 ml av isolering buffert 1 (IB1). Dessutom kan användning av trypsin störa vissa m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Eye Institute (R01 EY12998) till FH Andrade.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 95% CO2 / 5% O2 mix | Local gas company | |||
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma | A2754 | ||
| Blue Rizla Paper | Hansatech | 890101 | ||
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 500-0006 | ||
| Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) | Sigma | C2920 | ||
| Centrifuge 5804R | Eppendorf | |||
| Compressed nitrogen | Local gas company | |||
| D-mannitol | Sigma | M9647 | ||
| Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma | E3889 | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Bio-Rad | 161-0728 | ||
| Free fatty acid bovine serum albumin | Sigma | A8806 | ||
| Glutamic acid | Sigma | G5889 | ||
| HEPES sodium salt | Sigma | H7006 | ||
| Isotemp 3006D | Fisher Scientific | |||
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | ||
| Male Sprague Dawley Rats | Harlan | 300-500g | ||
| Malic acid | Sigma | M9138 | ||
| Minifuge | ISC Bioexpress | C1301P | ||
| Oligomycin | Sigma | O4876 | ||
| Oxygen electrode disc | Hansatech | S1 | ||
| Oxygraph | Hansatech | |||
| Oxygraph Plus V1.01 Software | Hansatech | |||
| pH-meter | Mettler Toledo | 1225506149 | ||
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P4417 | ||
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | ||
| Potassium phosphate | Sigma | P8416 | ||
| Potter-Elvehjem homogenizers | Fisher | 08-414-14A | ||
| PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane | Hansatech | S4 | ||
| SKIL 3320 drill press | Hardware store | |||
| Sucrose | Sigma | S5016 |
References
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts. Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).
- Duchen, M. R. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes. 53, S96-S102 (2004).
- Johannsen, D. L., Ravussin, E. The role of mitochondria in health and disease. Curr Opin Pharmacol. , (2009).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).
- Pallotti, F., Lenaz, G. Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines. Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).
- Gamboa, J. L., Andrade, F. H. Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).
- Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
