इंजेक्शन और electroporation द्वारा Zebrafish Otocyst में MIF Morpholinos के प्रत्यक्ष डिलिवरी भीतरी कान विकास को प्रभावित करता है
Summary
Morpholinos 24hpf पर zebrafish otocyst में सीधे देने के लिए एक विधि विकसित किया गया है. कान पुटिका और electroporation के लिए पैठ प्रभाव के लुमेन में morpholinos के microinjection का उपयोग, हम morpholinos के प्रभाव मस्तिष्क पर बाईपास और भीतरी कान के लिए विशेष प्रभाव प्राप्त करने में सक्षम थे.
Abstract
हाल के वर्षों में, electroporation आंख, मस्तिष्क, और zebrafish के somites सहित विभिन्न ऊतकों में डीएनए, शाही सेना, और morpholinos के vivo अभिकर्मक के लिए एक लोकप्रिय तकनीक बन गया है. आनुवंशिक हेरफेर के अन्य तरीकों पर electroporation का लाभ यह है कि विशिष्ट ऊतकों, लक्षित किया जा सकता है spatially और अस्थायी दोनों मौजूदा बिजली के आवेदन के द्वारा अणुओं की शुरूआत के लिए. यहाँ हम zebrafish के भीतरी कान के विकास के ऊतकों में mif mif – तरह morpholinos transfecting लिए electroporation के उपयोग का वर्णन . पिछले अध्ययनों में, mif morpholino 1 पर भ्रूण में इंजेक्ट – 8 सेल चरण के लिए तंत्रिका तंत्र और आंखों में बड़े पैमाने पर morphological परिवर्तन, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कान में हुई. भीतरी कान के विकास में बाद के चरणों में ऊतकों को लक्षित करके, हम विकासशील भीतरी कान में MIF के प्राथमिक प्रभावों का निर्धारण, माध्यमिक प्रभाव है कि अन्य ऊतकों के प्रभाव से परिणाम हो सकता है के लिए विरोध के रूप में कर सकते हैं. Phalloidin और acetylated न्यूरॉन्स, neuronal प्रक्रियाओं, और बालों के पीछे मैक्युला के साथ जुड़े कोशिकाओं की आकारिकी अध्ययन धुंधला ट्यूबिलिन का उपयोग करके, हम zebrafish भीतरी कान में लक्षित अभिकर्मक के लिए एक विधि के रूप में electroporation की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने में सक्षम थे. 24hpf भ्रूण के कान vesicles morpholinos और electroporated के साथ अंतःक्षिप्त थे और फिर भ्रूण कि कोई उपचार प्राप्त था या केवल एक या इंजेक्शन गया electroporated की तुलना में. भ्रूण कि इंजेक्शन थे और electroporated बाल सेल संख्या में कमी देखी गई, statoacoustic नाड़ीग्रन्थि (शिथिलता) और नियंत्रण समूहों के साथ तुलना में कम शिथिलता न्यूरॉन्स द्वारा innervation की कमी हुई. हमारे नतीजे बताते हैं कि बाद के चरणों में otocysts में morpholinos के प्रत्यक्ष वितरण गैर विशिष्ट तंत्रिका तंत्र और 1-8 सेल स्तर पर वितरित morpholinos के तंत्रिका शिखा प्रभाव से बचा जाता है. यह भी अनुमति देता है कि भीतरी कान और मस्तिष्क, तंत्रिका शिखा या periotic mesenchyme पर प्राथमिक प्रभाव से कान नहीं माध्यमिक प्रभाव के लिए निर्देशित कर रहे हैं प्रभाव की परीक्षा है.
Protocol
Discussion
हम सफलतापूर्वक 24 HPF zebrafish भ्रूण के कान में antisense oligonucleotide राज्यमंत्री शुरू. है कि इंजेक्शन और electroporation के बाद उठाया गया भ्रूण व्यवहार्य थे. यदि भ्रूण electroporation बच गया, वे भ्रूण कि कोई उपचार है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से भ्रूण कि केवल इंजेक्शन दिया गया था और भ्रूण कि केवल electroporated किया गया था प्राप्त किया था की तुलना में सामान्य दरों पर वृद्धि हुई.
हम कान इंजेक्शन और electroporation के बाद phalloidin और acetylated ट्यूबिलिन के साथ लेबलिंग के माध्यम से mif mif तरह – राज्यमंत्री के प्रभाव मनाया. पीछे मैक्युला के संवेदी बालों की कोशिकाओं में actin filaments के Phalloidin धुंधला mif mif तरह 24 HPF मंच पर एमओ की है कि electroporation इंगित करता है बाल सेल और / या stereocilia संख्या में परिवर्तन का कारण बनता है जब भ्रूण कि केवल राज्यमंत्री के साथ अंतःक्षिप्त थे की तुलना में (चित्रा 3). बाल सेल संख्या में यह कमी शेन एट अल के निष्कर्षों के साथ संगत है (प्रस्तुत). कि mif और mif की तरह राज्यमंत्री saccular मैक्युला में बालों की कोशिकाओं की संख्या में कमी का कारण है. भ्रूण कि राज्यमंत्री और electroporated के साथ अंतःक्षिप्त थे कि electroporation प्रदर्शित में बाल सेल संख्या में कमी कोशिका झिल्ली भर में राज्यमंत्री बढ़ने में सहायता, जिससे रूपात्मक प्रभाव की हद तक जब भ्रूण जिसमें कान पुटिका ही इंजेक्ट किया गया था की तुलना में बढ़ रही हो सकता है. Statoacoustic नाड़ीग्रन्थि की आकारिकी में परिवर्तन acetylated ट्यूबिलिन धुंधला हो जाना के माध्यम से मनाया गया. statoacoustic नाड़ीग्रन्थि द्वारा innervation की हद तक, भ्रूण है कि इंजेक्शन थे और electroporated शो neurites (चित्रा 5) की शाखाओं में कमी आई के रूप में प्रभावित किया गया था. वहाँ भी ganglionic कोशिकाओं और / या नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं के कम संख्या के संक्षेपण कम किया जा सकता है, क्योंकि acetylated ट्यूबिलिन धुंधला भ्रूण कि दोनों अंतःक्षिप्त थे electroporated में काफी कमी आई है. क्योंकि mif तंत्रिका तंत्र के विकास (सुजुकी एट अल., 2004) के लिए महत्वपूर्ण होना दिखाया गया है, electroporation के बाद देखा परिवर्तन की वृद्धि mif और mif की तरह neuroblast कोशिकाओं में एमओ समाधान. अभिकर्मक के परिणाम हो सकता है
एक विकासशील ऊतक में सीधे antisense oligo morpholinos के electroporation है कि ऊतक के विकास के दौरान भ्रूण में दोनों spatially और अस्थायी, जीन की अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है. Mif और mif की तरह भीतरी कान के ऊतकों में राज्यमंत्री के electroporation दोनों पीछे मैक्युला और statoacoustic नाड़ीग्रन्थि की असामान्य आकारिकी में हुई. भ्रूण कि इंजेक्ट किया गया था और है कि कोई भी उपचार प्राप्त किया था या भ्रूण कि या तो केवल था इंजेक्शन गया या केवल electroporated के साथ भ्रूण के साथ तुलना में electroporated में पीछे मैक्युला में संवेदी बालों की कोशिकाओं की संख्या में कमी थी. वहाँ भी statoacoustic नाड़ीग्रन्थि और शिथिलता के आकार से पीछे संवेदी पैच के innervation की डिग्री में एक कमी थी. Electroporation विशिष्ट ऊतकों में बड़े अणुओं के साथ, transfecting वांछित ऊतकों में है कि विशेष रूप से डीएनए, शाही सेना, या एमओ के प्राथमिक प्रभाव देख और अन्य ऊतकों पर माध्यमिक प्रभाव से इन भेदभाव, मस्तिष्क, तंत्रिका शिखा और सहित के लाभ के लिए एक महत्वपूर्ण तरीका है भीतरी कान के विकास पर periotic mesenchyme (Barald और Kelley, 2004).
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम KFB के लिए बहरापन रिसर्च फाउंडेशन से Yc एस और NSF (0930096 IOS) अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
KFB: 2 NIH / NINDCD DC04184 RO1, 3R01DC004184-08W1 , NSF DBI 0832862, NSF IOS 0930096
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sutter P-97 electrode puller | Equipment | |||
| PV820 Pneumatic PicoPump | Equipment | World Precision Instruments | ||
| M3301L Manual Micromanipulator | Equipment | World Precision Instruments | ||
| Leica S6D stereomicroscope | Equipment | |||
| Protect CUY-21 Edit Square Wave Electroporator | Equipment | |||
| Olympus FV500 confocal microscope | Equipment | |||
| 0.01 inch Platinum Wire | Supply | A-M Systems | 711000 | |
| Shrink Tubing | Supply | Newarck Electronics | 03F3172 | |
| Socket Crimp Terminal | Supply | DigiKey | 82PECT-ND | |
| Capillaries | Supply | Stoelting Company | 50613 | |
| Modeling clay | Supply | |||
| Plastic 100 mm Petri dishes | Supply | Falcon | ||
| 6 well plastic plates | Supply | Falcon |
- MOs: 0.3 mM of a combination of for mif, mif-like MO1, and mif-like MO2 was used.
Mif MO is complimentary to the start codon of zebrafish mif mRNA: 5′-acatcggcatgactgcgacagagat-3′. Two MOs were used for mif-like. mif-like MO1 is complimentary to the translational start site: 5′-GTTTCTATATTTATGAACGGCATGA-3′, while mif-like MO2 derived from AS sequence at the intron1/exon 2 boundary: 5′-GATTCATCCTCTGAAGACGTAAGCC-3′. Control MO was the scrambled nucleotide sequence from Gene Tools: 5′-CCTCTTACCTCAGTTACAATTTATA- 3′. - methylene blue (0.3 ppm) in fish water
- MS222 (tricaine, Sigma; 0.64 mM in fish water)
- Low-melting point agarose (LMPA; Roche)
- phenol red (Sigma)
- Anti-acetylated tubulin (Sigma)
- Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse second antibody (Molecular probes)
- Texas red-phalloidin (Molecular probes)
References
- Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus. J Neurosci Methods. 50, 123-127 (1993).
- Suzuki, M., Takamura, Y., Maeno, M., Tochinai, S., Iyaguchi, D., Tanaka, I., Nishihira, J., Ishibashi, T. Xenopus laevis macrophage migration inhibitory factor is essential for axis formation and neural development. J Biol Chem. 279, 21406-21414 (2004).
- Barald, K. F., Kelley, M. W., W, M. From placode to polarization: new tunes in inner ear development. Development. 131, 4119-4135 (2004).
