माप Caenorhabditis एलिगेंस 96 खैर microtiter प्लेट्स में लाइफ स्पैन

Summary

इस प्रोटोकॉल में हम एक विधि के लिए उपाय मौजूद<em> Caenorhabditis एलिगेंस</em> उम्र 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट में.

Abstract

जीवन एक जैविक प्रक्रिया कई आनुवंशिक रास्ते के द्वारा विनियमित है. एक उम्र बढ़ने के जीव विज्ञान की जांच की रणनीति के लिए जानवरों के अध्ययन है कि उम्र नियामक रास्ते के घटकों में बंदरगाह म्यूटेशनों. यदि इन म्यूटेशनों उम्र नियामक मार्ग के समारोह में उपद्रव और इसलिए पूरे जीव के जीवन को बदल, वे ^1-3 महत्वपूर्ण यंत्रवादी अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं.

उम्र के नियमन की जांच के लिए एक रणनीति के लिए उपद्रव उम्र नियामक रास्ते छोटे अणुओं का उपयोग करने के लिए है. तिथि करने के लिए, अणुओं के एक नंबर करने के लिए विभिन्न मॉडल जीवों में उम्र बढ़ाने में जाना जाता है और औजार के रूप में इस्तेमाल ^किया 4-16 उम्र बढ़ने के जीव विज्ञान का अध्ययन . पहचान अणुओं की संख्या इस प्रकार अब तक आनुवंशिक "toolset है कि उम्र बढ़ने के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए उपलब्ध है की तुलना में छोटा है.

Caenorhabditis एलिगेंस एक सिद्धांत के लिए अपनी उत्कृष्ट आनुवंशिकी और तीन सप्ताह से कम उम्र की वजह से उम्र बढ़ने अध्ययन किया मॉडल है. हाल ही में, C.elegans phenotype आधारित अपने छोटे आकार और उसके microtiter प्लेट में विकसित करने की क्षमता की वजह से दवा ^5,7,16-20 स्क्रीन के लिए एक मॉडल जीव के रूप में उभरा है.

यहाँ हम 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेटों में C.elegans उम्र को मापने के लिए एक परख उपस्थित थे. परख विकसित किया गया था और सफलतापूर्वक अणुओं है कि C.elegans ⁷ उम्र बढ़ाने के लिए बड़े पुस्तकालयों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया. परख की विश्वसनीयता कई परीक्षणों में मूल्यांकन किया गया था: पहला, जंगली प्रकार अलग तापमान पर हो पशुओं की उम्र को मापने के द्वारा, दूसरा, बदल lifespans के साथ म्यूटेंट की उम्र को मापने के द्वारा, विभिन्न सांद्रता के जीवन में प्रतिक्रिया में परिवर्तन को मापने के द्वारा तीसरी, एंटी Mirtazepine. Mirtazepine पहले C.elegans ⁷ में उम्र बढ़ाने दिखाया गया है. इन परीक्षणों के परिणाम बताते हैं कि परख अन्य assays से पिछले निष्कर्षों को दोहराने में सक्षम है और मात्रात्मक है. microtiter प्रारूप भी इस उम्र परख स्वचालित तरल हैंडलिंग सिस्टम के साथ संगत करता है और स्वचालित प्लेटफार्मों में एकीकरण की अनुमति देता है है.

Protocol

अवलोकन: प्रोटोकॉल चार भागों में विभाजित है. भाग 1 का वर्णन कैसे खिला बैक्टीरिया को तैयार करने के लिए. भाग 2 का वर्णन कैसे कीड़ा संस्कृति को तैयार करने के लिए. 3 भाग का वर्णन कैसे उम्र स्कोर. भाग 4 के कुछ प्रतिनिधि परिणामों से पता चलता है, और 5 भाग का वर्णन कैसे आवश्यक समाधान तैयार करने के लिए. जीवन प्रयोगों कई हफ्तों लेने के लिए पूरा. प्रोटोकॉल सप्ताह के प्रत्येक चरण के लिए, दिन, और दिन के समय के लिए योजना की सुविधा शामिल है. L4 मंच (0 दिन) पूरे प्रोटोकॉल के लिए संदर्भ बिंदु के रूप में प्रयोग किया जाता है. 1. जीवाणु दूध पिलाने की तैयारी इस अनुभाग में खिला जीवाणुओं की तैयारी का वर्णन करता है. विशिष्ट ई. कोलाई तनाव C.elegans फ़ीड करने के लिए प्रयोग किया जाता है OP50 बुलाया. इस प्रोटोकॉल के लिए अन्य जीवाणुओं के साथ कीड़ा संस्कृति के पार संक्रमण को रोकने के पहले, OP50 तनाव / Carbenicillin एम्पीसिलीन 21 प्रतिरोधी बनाया गया है. OP50 चार से पाँच दिनों के अग्रिम में तैयार करें. सभी OP50 के साथ संपर्क में आने सामग्री बाँझ होना चाहिए. दिन -7: गुरुवार (1 सप्ताह): एक OP50 कॉलोनी और रात खत्म सेते 37 ° सी एक जीवाणु एक प्रकार के बरतन में से 100 μg / एमएल एम्पीसिलीन और 0.1 μg / एमएल Amphotericin बी युक्त टीबी के 5 एमएल टीका लगाना. -6 दिन: शुक्रवार (1 सप्ताह). 8:30 सुबह. जल्दी टीका लगाना संस्कृति के लिए पर्याप्त समय संतृप्ति तक पहुँचने के लिए अनुमति 300 एमएल के 50 μg / एमएल एम्पीसिलीन युक्त टीबी में 1:2000 OP50 के रातोंरात संस्कृति पतला. 37 में 8-12 घंटे के लिए एक जीवाणु हिलनेवाला ° सी में संस्कृति सेते हैं जब तक संतृप्ति तक पहुँच जाता है. संस्कृति अब 14 घंटे से विकसित करने के लिए अनुमति नहीं है. एक बाँझ, पूर्व भारित centrifugation ट्यूब में OP50 स्थानांतरण. गोली एक तालिका शीर्ष अपकेंद्रित्र में 3500 rpm (2200 XG) पर 10 मिनट के लिए centrifugation द्वारा OP50. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और पुनः निलंबित बाँझ पानी में OP50 गोली और फिर से गोली centrifugation द्वारा. इस धोने दो बार दोहराएँ. दूसरा धोने के बाद, ध्यान से सभी शेष पानी को हटा दें. ट्यूब में पानी नहीं छोड़ा जाना चाहिए. Centrifugation ट्यूब युक्त गोली वजन और खाली centrifugation ट्यूब के वजन घटाना क्रम में गोली का वजन निर्धारित करने के लिए. एस पूरा में अच्छी तरह से गोली 100 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता के लिए फिर से निलंबित. नहीं clumps छोड़ दिया जाना चाहिए. 100 मिलीग्राम / एमएल OP50 की एकाग्रता 2 x10 10 बैक्टीरिया / एमएल के अनुरूप होना चाहिए. एक तस्वीर स्पेक्ट्रोमीटर का प्रयोग एमएल प्रति बैक्टीरिया की संख्या निर्धारित करती है कि ऑप्टिकल और एमएल प्रति बैक्टीरिया के घनत्व की संख्या के बीच संबंधों में जाना जाता है. यदि आवश्यक हो, OP50 खिला 2 x10 10 बैक्टीरिया / एमएल समाधान की एकाग्रता को समायोजित . 4 में OP50solution स्टोर ° सी जब तक यह कीड़ा संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जाता है. 2. एक तुल्यकालिक इल्ली संस्कृति की तैयारी इस अनुभाग में कीड़ा संस्कृति की तैयारी का वर्णन करता है. अपने लक्ष्य को कीड़े की एक उम्र तुल्यकालिक जनसंख्या उत्पन्न है. सभी सामग्री C.elegans के साथ संपर्क में चरण 5 में ब्लीच उपचार के बाद आ बाँझ होना चाहिए. प्लेट्स 20 में रखा जाता है डिग्री सेल्सियस जब तक अन्यथा इंगित. दिन -6: शुक्रवार (1 सप्ताह), 4:00 बजे: एक ताजा थाली करने के लिए पशुओं स्थानांतरण एक 5-10 दिन पुरानी एन जी एम थाली जिस पर कीड़ा आबादी का बहुमत भूखे L1 लार्वा के होते हैं ले लो. शीघ्र ही यह एक Bunsen बर्नर पर हीटिंग द्वारा एक धातु रंग जीवाणुरहित. इसे शांत करते हैं. ठंडा रंग का प्रयोग भूखे कीड़े युक्त थाली से बाहर अगर विखंडू में कटौती. एक ताजा 10 सेमी एन जी एम थाली वरीय पर OP50 के साथ इन विखंडू के कई स्थानांतरण. के लिए लगभग सेते हैं. 20 पर 65 घंटे डिग्री सेल्सियस जब तक कीड़ा आबादी का बहुमत gravid वयस्कों के होते हैं. समय यह भूखे L1 पशुओं के लिए लेता है gravid वयस्कों में विकसित तनाव से तनाव के लिए भिन्न हो सकते हैं. दिन -3: (2 सप्ताह) सोमवार 10:00 रहा हूँ: एक तुल्यकालिक आबादी की स्थापना उन्हें धोने से 5-10 एमएल बाँझ पानी के साथ थाली से 10 सेमी की थाली से कीड़े लीजिए. 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में कीड़ा / पानी समाधान स्थानांतरण. एक tabletop अपकेंद्रित्र में 1200 rpm (280 XG) में 2 मिनट centrifuging कीड़े धो लें. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 10 एमएल पानी जोड़ें. दोहराएँ. सतह पर तैरनेवाला निकालें और हौसले से तैयार ब्लीच / NaOH समाधान (2.5 एमएल घरेलू ब्लीच, 1 एमएल 10N NaOH, 6.5 एमएल एच 2 हे) के 5 एमएल जोड़ने . आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं जब तक कीड़े खुला तोड़ने. धीरे हर मिनट भंवर करने के लिए सुनिश्चित करें. विदारक खुर्दबीन के नीचे प्रतिक्रिया की प्रगति मॉनिटर. जैसे ही सभी वयस्कों को भंग M9 बफर के 5 एमएल जोड़ने के लिए प्रतिक्रिया बेअसर. अंडे 2500 rpm पर 2 मिनट centrifuging के द्वारा तीन बार धो (10 एमएल M9 बफर के साथ1100 XG). अंडे के साथ एक बार धो 10 एमएल 2500 rpm (1100 XG) में 2 मिनट centrifuging द्वारा एस पूरा. सतह पर तैरनेवाला निकालें जोड़ने के लिए, 10 एमएल एस को पूरा करने और एक ताजा 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब का हल हस्तांतरण. 40 एमएल की एक अंतिम मात्रा करने के लिए एस पूरा 30 एमएल जोड़ें. धीरे ट्यूब रात एक nutator या इसी तरह के डिवाइस पर कमरे के तापमान पर हिला. -2 दिन: मंगलवार (2 सप्ताह), दोपहर 12:00: प्लेटों में जानवरों के बीज विदारक गुंजाइश के तहत जांच, चाहे कीड़े रात के दौरान रची. 10 μL विदारक गुंजाइश का उपयोग बूंदों में कीड़े की संख्या की गणना के द्वारा एस पूरा समाधान में कीड़े की एकाग्रता का निर्धारण करते हैं. प्रत्येक नमूना के लिए कम से कम 10 बूँदें गणना. 80-100 कीड़े / एस पूरा एमएल के एक एकाग्रता में कीड़े पुनः निलंबित. 0.1 μg / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए 50 μg / एमएल और Amphotericin बी (250 μg एमएल / शेयर) के अंतिम एकाग्रता Carbenicillin (शेयर 100 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ें. एक nutator पर हिलाएँ. यदि कीड़े की बड़ी मात्रा में तैयार करने, फ़िल्टर टोपी के साथ एक 600 एमएल nunclon कुप्पी का उपयोग करें. 2:30 बजे भाग 1 में 6 मिलीग्राम / एमएल (= 1.2 x10 9 बैक्टीरिया / एमएल) की अंतिम एकाग्रता के लिए तैयार OP50 जोड़ें. OP50 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर लौटें एक 96 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से में worm/OP50 समाधान के 120 μL स्थानांतरण. एक पारदर्शी नीचे के साथ अच्छी तरह से 96 प्लेट का उपयोग करें. निलंबन में कीड़े रखने के लिए, जबकि pipetting सुनिश्चित करें. एक टेप मुहर का उपयोग करने के लिए प्रदूषण और वाष्पीकरण से बचने के प्लेट सील. थाली पर 2 मिनट के लिए एक microtiter प्लेट हिलनेवाला हिलाओ और 20 में 2 दिन ° सी के लिए सेते हैं जब तक पशुओं L4 मंच तक पहुँचने. 0 दिवस: गुरुवार (2 सप्ताह) दोपहर से पहले: Fluorodeoxyuridine जोड़ने के द्वारा पशुओं जीवाणुरहित (FUDR ) बाँझ के लिए पशुओं के एक 0.6 मिमी FUDR शेयर प्रत्येक अच्छी तरह से हल के 30 μL जोड़ने. यह कदम μL 150 प्रत्येक में अच्छी तरह से अंतिम मात्रा लाता है और 6mg एमएल / से 5 मिलीग्राम / एमएल (1×10 9 बैक्टीरिया / एमएल) OP50 के अंतिम एकाग्रता कम कर देता है. प्लेट का उपयोग कर टेप sealers सील और यह एक microtiter प्लेट हिलनेवाला पर 2-3 मिनट के लिए हिला. यदि OP50 -2 दिन पर 2:30 पर जोड़ा गया है, यह महत्वपूर्ण है कि FUDR दोपहर से पहले जोड़ा जाता है. 20 ° सी इनक्यूबेटर प्लेटें लौटें 1 दिन: शुक्रवार (2 सप्ताह): संस्कृति को ड्रग्स जोड़ें 9:00 तक पशुओं के अधिकांश और gravid किया जाना चाहिए कई अंडे प्रत्येक होते हैं. दवाओं के प्रभाव जिनकी उम्र पर वांछित एकाग्रता में परीक्षण किया जा रहा है जोड़ें. DMSO में दवाओं भंग यदि DMSO के अंतिम सांद्रता DMSO सांद्रता 0.6% C.elegans उम्र कम से अधिक के रूप में 0.6% से अधिक नहीं होनी चाहिए. दवा के अलावा के बाद, टेप मुहर के साथ प्लेटें मुहर और यह एक microtiter प्लेट हिलनेवाला पर 2-3 मिनट के लिए हिला. 20 ° सी इनक्यूबेटर प्लेटें लौटें दवाओं जोड़ना कभी कभी प्लेट प्रति कुछ जानवरों मार, विशेष रूप से पानी की तुलना में एक अन्य विलायक का उपयोग कर यदि. एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए मरे हुए जानवरों के लिए जाँच करने के लिए. आम तौर पर, वहाँ 96 अच्छी तरह से थाली के प्रति कम से कम 10 मृत जानवरों होना चाहिए. 20 ° सी इनक्यूबेटर प्लेटें लौटें. 4 दिन: सोमवार (3 सप्ताह): बदलें sealers ताजा ऑक्सीजन की अनुमति संस्कृति में प्रवेश मुहर हटायें 1minute इंतजार करना और प्लेट reseal. प्लेट एक microtiter प्लेट हिलनेवाला पर 2-3 मिनट के लिए हिलाओ. हर हफ्ते एक बार दोहराएँ. 5 दिन: मंगलवार (3 सप्ताह): नई भुखमरी को रोकने OP50 जोड़ें 100 मिलीग्राम / एमएल OP50 समाधान है कि एक भाग में 96 को भुखमरी को रोकने के कुओं के प्रत्येक के लिए तैयार किया गया था के 5 μL जोड़ें. 3. जीवन के स्कोरिंग. यह खंड का वर्णन कैसे सिंक्रनाइज़ कीड़ा जनसंख्या का भाग 2 के अस्तित्व तक पशुओं की मृत्यु हो गई निगरानी है. 96 अच्छी तरह प्लेटें में पशुओं का निरीक्षण, एक 2x या 2.5x उद्देश्य के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग करें. कीर्तिमान अस्तित्व डेटा तीन बार एक हफ्ते, सोमवार, बुधवार और शुक्रवार. आंदोलन का उपयोग करें के लिए तय है कि जानवरों ज़िंदा है या मर रहे हैं. मजबूत प्रकाश, विशेष रूप से नीले प्रकाश को स्थानांतरित करने के लिए पशुओं लाती है. परख से मृत पशुओं को दूर मत करो. कभी कभी, जानवरों है कि चाल और पिछले गिनती में नहीं थे मृत निर्धारित किया पर बाद में स्थानांतरित हो सकता है. 0 दिन, प्रयोग की शुरुआत में प्रत्येक कुएं में कीड़े की कुल संख्या गिनती. कुओं कि इन कुओं में जानवरों के रूप में विश्लेषण से 18 से अधिक पशुओं होते सेंसर OP50 पर्याप्त नहीं है और आहार प्रतिबंध के प्रभाव दिखाने जाएगा. आदेश में मौका है कि पशुओं को ले जाने के 96 2 मिनट के लिए एक microtiter प्लेट हिलनेवाला पर अच्छी तरह से थाली हिला बढ़ाने के लिए. पहले गिनती. प्रत्येक गिनती सत्र, रिकॉर्ड तारीख और पशुओं की संख्या में जोजीवित पशुओं के रूप में कदम. तरल में आंदोलन बहुत ठोस मीडिया पर की तुलना में आसान है और मजबूत रोशनी द्वारा प्रेरित किया जा सकता है. एक उच्च बढ़ाई उपयोग ग्रसनी की टिप के उन लोगों की तरह बहुत ही सूक्ष्म आंदोलनों जगह मदद मिल सकती है. इस तरह के सूक्ष्म आंदोलनों अक्सर केवल बहुत पुराने पशुओं में मनाया आंदोलन कर रहे हैं. 20 ° सी इनक्यूबेटर प्लेटें लौटें दोहराएँ 2-4 दो से तीन दिनों के कदम हर जब तक सभी जानवरों मर चुके हैं. 4. प्रतिनिधि परिणाम. यह खंड कैसे उम्र इस परख और कुछ प्रतिनिधि परिणाम द्वारा उत्पन्न डेटा की रिकॉर्ड रखने के लिए एक उदाहरण दिखाता है. चित्रा 1A कैसे इस परख के दौरान उम्र डेटा रिकॉर्ड करने के लिए एक उदाहरण दिखाता है. एक एक्सेल शीट प्रत्येक कुएं में आबादी के अस्तित्व का ट्रैक रखने के लिए प्रयोग किया जाता है. प्रत्येक अच्छी तरह के लिए यह थाली में समन्वय, तनाव, दवा, दवा की एकाग्रता, और 0 दिन जीवित पशुओं की कुल संख्या (x0) के प्रयोग की शुरुआत में दर्ज की गई है. रिकॉर्ड तिथि, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जीवित और मृत पशुओं की संख्या तीन बार एक सप्ताह के क्रम में प्रत्येक कुएं में विभिन्न आबादी के अस्तित्व का पालन करने के लिए. परिणाम ग्राफ करने के लिए, प्रत्येक दिन के लिए जीवित पशुओं के अंश की गणना और यह दिनों में समय के एक समारोह के रूप में साजिश. पी मान STATA या इसी तरह के सॉफ्टवेयर की तरह सांख्यिकीय संकुल का उपयोग कर की गणना की जानी चाहिए. मध्यम उम्र के C.elegans तापमान निर्भर है. चित्रा 1B से पता चलता है कि उम्र में तापमान परिवर्तन निर्भर सही उम्र 22 परख आधारित microtiter द्वारा reproduced हैं. इसी तरह, microtiter प्लेट परख lifespans है कि जंगली प्रकार N2 23-24 25 (चित्र 1C) जानवरों से अलग करने के लिए रिपोर्ट म्यूटेंट से जीवन में परिवर्तन reproduces. परख भी अधिक मात्रात्मक बयान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Fig1D मतलब उम्र Mirtazepine 7 एकाग्रता के एक समारोह के रूप में प्लॉट किए जाते है. प्रत्येक डेटा बिंदु 7-12 जनसंख्या का मतलब उम्र, एक अच्छी तरह से अलग में रहने वाले प्रत्येक का प्रतिनिधित्व करता है. हालांकि अच्छी तरह से प्रति पशुओं की संख्या अपेक्षाकृत कम है (5-15 जानवरों) अच्छी तरह से अच्छी तरह से भिन्नता अपेक्षाकृत छोटा है के रूप में त्रुटि सलाखों से देखा जा सकता है है. चित्रा 1. Microtiter प्लेट आधारित जीवन परख सही उम्र में परिवर्तन साहित्य में रिपोर्ट reproduces. (ए) नमूना डेटा एक एक्सेल स्प्रेडशीट में एकत्र. प्रत्येक गिनती सत्र की तारीख के दौरान, अच्छी तरह से समन्वय और जीवित और मृत जानवर की संख्या दर्ज की गई थी. प्रयोग की शुरुआत में, प्रत्येक कुएं में पशुओं की कुल संख्या निर्धारित किया गया था. (बी) जंगली प्रकार की जीवन रक्षा वक्र जानवरों (N2) 20 से बढ़ी डिग्री सेल्सियस और 25 डिग्री सेल्सियस (सी) म्यूटेशनों कि जीवन प्रभावित ले उपभेदों के जीवन रक्षा घटता. सभी चार उपभेदों समानांतर में 20 डिग्री सेल्सियस पर assayed गया (डी) Mirtazepine इलाज N2 जानवरों की खुराक प्रतिक्रिया वक्र. मीन उम्र Mirtazepine एकाग्रता के एक समारोह के रूप में प्लॉट किए जाते है. त्रुटि सलाखों के SEM हालत प्रति 8 कुओं से संकेत मिलता है. 5. माल. M9 बफर, 1000 एमएल 6 छ ना 2 4 HPO 3 जी 2 के.एच. पीओ 4 5 छ NaCl 0.25 छ 4 MgSO ∙ 7 2 हे 1000 एमएल विआयनीकृत जल जोड़ें आटोक्लेव Potassiumphosphate बफर 6.0 पीएच, 1000 एमएल 136 छ 2 के.एच. पीओ 4 900 एमएल विआयनीकृत जल जोड़ें 6.0 करने के लिए 5M KOH के साथ पीएच समायोजित 1000 एमएल विआयनीकृत जल जोड़ें आटोक्लेव ट्रेस धातु समाधान 1.86 छ ना 2 EDTA 0.69 छ 4 FeSO ∙ 7 2 हे 0.20 छ 2 MnCl ∙ 4H 2 हे 0.29 छ 4 ∙ 7 2 हे ZnSO .016 छ 4 CuSO 1000 एमएल पानी विआयनीकृत आटोक्लेव और अंधेरे में दुकान. एस बेसल मध्यम, 1000 एमएल 5.9 छ NaCl 1M पोटेशियम फॉस्फेट, पीएच 6.0 के 50 एमएल 1000 एमएल पानी विआयनीकृत आटोक्लेव समाधान शांत चलो और फिर जोड़ने 5mg / एमएल कोलेस्ट्रॉल (एट OH में भंग) के 1 एमएल. पोटाशियम साइट्रेट 1M, 1000 एमएल 268.8 छ tripotassium साइट्रेट 26.3 साइट्रिक एसिड monohydrate 900 एमएल विआयनीकृत पानी जोड़ें 6.0 करने के लिए 5M KOH के साथ पीएच समायोजित 1000 एमएल विआयनीकृत जल जोड़ें आटोक्लेव एस पूरा मध्यम, 1000 एमएल 977 एमएल एस बेसल 10 एमएल 1M पोटेशियम साइट्रेट 6 पीएच (बाँझ) 10 एमएल ट्रेस धातु समाधान (बाँझ) 3 मिलीलीटर 1M 2 CaCl (बाँझ) 3 एमएल 1M MgSO 4 (बाँझ) एन जी एम अगर 3.0g NaCl 2.5g Pepton(कैसिइन से, अग्नाशय के पचाने में) 17g अग्रवाल विआयनीकृत जल 975 एमएल के लिए और एक भावप्रवण पट्टी जोड़ें आटोक्लेव शांत autoclaving 55 से नीचे के बाद डिग्री सेल्सियस और निम्नलिखित घटकों को जोड़ने: 1M 2 CaCl (बाँझ) के 0.5 एमएल इथेनॉल में 5mg / एमएल कोलेस्ट्रॉल के 1 एमएल 1M 4 MgSO (बाँझ) के 1 एमएल 25 एमएल Potassiumphosphate बफर, पीएच 6.0 (बाँझ) टीबी, 1000 एमएल 12g Bacto Tryptone 24 छ खमीर निकालें 4 एमएल ग्लिसरॉल 900 एमएल विआयनीकृत पानी जोड़ें आटोक्लेव शांत autoclaving 55 से नीचे के बाद डिग्री सेल्सियस और निम्न घटक जोड़ने: 0.17M के.एच. 2 4 / 0.72MK पीओ HPO 2 4 के 100 एमएल जोड़ने 0.6 मिमी (FUDR, सिग्मा बिल्ली F0503 #) Fluorodeoxyuridine, 1000 एमएल 100 मिलीग्राम FUDR 670 एमएल एस पूरा बाँझ में भंग, 10 या 45 एमएल एमएल aliquots बनाते हैं. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर 100 मिलीग्राम / एमएल Carbenicillin, 10 एमएल 1 ग्राम Carbenicillin 10 एमएल बाँझ विआयनीकृत जल बाँझ छानना और विभाज्य -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर 50 μg / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में प्रयोग 250ug / एमएल Amphotericin बी, 4 एमएल 1mg Amphotericin बी 4 एट OH एमएल -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर 0.1 μg / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता में प्रयोग

Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेटों में C.elegans उम्र की माप की अनुमति देता है. प्रतिनिधि परिणामों में दिखाया अनुभाग यह मज़बूती से पिछले निष्कर्ष replicates और मात्रात्मक जानकारी प्रदान करता है है. इस परख का उपयोग हम सफलतापूर्वक C.elegans जीवन पर उनके प्रभाव के लिए 89,000 अणुओं से अधिक जांच की.

दवा स्क्रीनिंग के प्रयोजन के लिए, एक 96 अच्छी तरह से microtiter प्लेट प्रारूप में उम्र को मापने शास्त्रीय ठोस मीडिया परख पर कई फायदे हैं. यह मीडिया तैयारी, ऊष्मायन अंतरिक्ष की राशि है, और दवा की राशि की आवश्यकता के लिए आवश्यक श्रम को कम कर देता है. 96 अच्छी तरह प्रारूप और माइक्रोस्कोपी सेटअप उच्च throughput प्रदर्शन के लिए पूरे परख के स्वचालन की अनुमति देते हैं.

परख के विकास के दौरान प्रत्येक चर और संयोजन के लिए एकाधिक मानों उसके C.elegans जीवन पर उनके प्रभाव के लिए परीक्षण किया गया. इन परीक्षणों अलग OP50 3 से 10 से लेकर एकाग्रता शामिल मिलीग्राम / एमएल (3, 4, 6, 8, 10 मिलीग्राम / एमएल), 7 से 45 (7, 10, 15, 22, 45 को लेकर अच्छी तरह से प्रति कीड़े के विभिन्न संख्या अच्छी तरह / कीड़े), अलग संस्कृति से 40 अच्छी तरह से 150 प्रति μL (40, 60, 80, 100, 120, 150 μL), और बफर संरचना में परिवर्तन को लेकर मात्रा. Carbenicillin प्रतिरोधी OP50 के साथ खिलाया यदि Carbenicillin न तो और न ही सांद्रता में Amphotericin बी ने संकेत दिया C.elegans जीवन को प्रभावित पाए गए. प्लेटों के सतत कोमल मिलाते हुए, जैसा कि अक्सर C.elegans तरल संस्कृति में सिफारिश की है, इस परख में प्रयुक्त छोटे संस्करणों के लिए अनावश्यक पाया गया था . कोमल मिलाते लेकिन अगर बड़े कुओं के साथ microtiter प्लेट के लिए इस्तेमाल किया जा रहे हैं आवश्यक है. मूल्यों का संकेत दिया है इस प्रोटोकॉल में सावधानी से किया गया है विभिन्न परीक्षण शर्तों के सांख्यिकीय तुलना के आधार पर चयनित.

इस परख का सबसे आश्चर्यजनक विशेषता शायद तथ्य यह है कि C.elegans 96 अच्छी तरह प्लेटें कि टेप के साथ सील कर रहे हैं में रखा जा सकता है. पक्ष द्वारा साइड तुलना, एक प्लास्टिक की मुहर के साथ बंद प्लेटों में या sealers है कि हवा आदान – प्रदान की अनुमति के साथ बंद प्लेटों में unsealed प्लेटों में सुसंस्कृत जानवरों की उम्र में कोई फर्क नहीं प्रकट किया था,. सभी तीन स्थितियों में, जानवरों L1 से 65 घंटे के भीतर gravid वयस्कों के लिए बहुत homogenously विकसित और बहुत तुलनीय lifespans दिखाया. एन जी एम पर समानांतर में बड़े पशु के रूप में थोड़ा तेजी से विकसित की है, लेकिन इस अंतर या एक मुहर के अभाव की उपस्थिति के स्वतंत्र थी.

प्रस्तुत प्रोटोकॉल जीवित बैक्टीरिया पर आधारित है, लेकिन मृत बैक्टीरिया के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. हालांकि, एक तरल परख में एक एकल जीवित बैक्टीरिया जल्दी गुणा और संस्कृति को पुनः – पॉप्युलेट कर सकते हैं. हमारे हाथों में, केवल विश्वसनीय हद तक है कि वे तरल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जीवाणुओं को मारने के लिए रास्ता गामा विकिरण के साथ बैक्टीरिया के लंबे समय तक इलाज से है.

एक महत्वपूर्ण बिंदु एक उम्र प्रयोग के नियोजन में विचार का पता लगाने की शक्ति है. प्रभाव के आकार पर निर्भर करता है, ब्याज की दवा के प्रभाव के कई कुओं में परीक्षण किया जाना चाहिए. एक ठेठ परख 4 दवा और इलाज 4 नियंत्रण कुओं, इसी के लिए मोटे तौर पर प्रत्येक 40-50 पशुओं में, प्रयोगों के 95% से अधिक में एक उम्र में 30% की वृद्धि का पता लगाने के लिए पर्याप्त होना चाहिए. 14% की वृद्धि केवल मामलों के 60% में पाया जाता है और इसलिए अधिक को दोहराने के कुओं की आवश्यकता है.

उम्र के इस परख द्वारा उत्पन्न डेटा के धन प्रयोग करने के लिए विकसित करने के लिए या ^{विशिष्ट} parametrical Gompertz एक मॉडल तनाव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. ये Gompertz मॉडल पता लगाने की शक्ति का निर्धारण करने के लिए और बड़े पैमाने पर स्क्रीन के लिए झूठी सकारात्मक और नकारात्मक की संख्या का अनुमान करने के लिए उपयोगी होते हैं. हम अंधा प्रयोगों में इन मॉडलों की भविष्यवाणी की पुष्टि और उन्हें इस्तेमाल करने के लिए बड़े परदे में झूठी नकारात्मक की संख्या (अप्रकाशित परिणाम) का अनुमान है.

संक्षेप में, हम आशा है कि प्रस्तुत परख महान उपयोग करने के लिए छोटे अणुओं है कि C.elegans की उम्र बढ़ाने और अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने की पहचान के हो जाएगा.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Amphotericin B		Calbiochem	cat# 171375	Also called Fungizone
FUDR		Sigma-aldrich	cat# F0503	FUDR is inactivated by heat, thaw in cold water
Mianserin		Sigma-aldrich	M2525-250MG	Use as positive control at 50μM final concentration
Cyproheptadine		Sigma-aldrich	cat#C6022-MG	Alternative positive control at 10 μM final concentration
Sealing Tape		Nunc	cat# 236370	Polyester, non-sterile
96 well plate		Falcon	cat# 351172	Non-treated, transparent, sterile individual packaged, polystyrene
Nunclon flask		Nunc	cat# 178883	used for large volumes