Ett stort hinder för biokemiska analyser av ribosomer som innehåller begynnande peptidyl-tRNAs har närvaron av andra ribosomer i samma prov, ribosomer inte inblandad i översättningen av specifika mRNA sekvens som analyseras. Vi utvecklade en enkel metod att rena, exklusivt, ribosomerna som innehåller den begynnande peptidyl-tRNA av intresse.
Nyligen har strukturella och biokemiska studier detaljerade många av de molekylära händelser som inträffar i ribosomen under hämning av proteinsyntesen genom antibiotika och under begynnande polypeptid syntes. Några av dessa antibiotika, och reglerande vardande polypeptider oftast i form av peptidyl-tRNAs, hämmar antingen peptidbindningen bildning eller översättning uppsägning 1-7. Dessa hämmande händelser kan stoppa rörelsen av ribosomen, kallas ett fenomen "translationell gripande". Översättning gripandet orsakas av antingen ett antibiotikum eller en begynnande polypeptid har visat att reglera uttrycket av gener involverade i olika cellulära funktioner som celltillväxt, antibiotikaresistens, protein translokation och cellernas ämnesomsättning 8-13. Kunskap om hur antibiotika och reglerande begynnande polypeptider ändra ribosomen funktionen är nödvändigt om vi ska förstå den fullständiga roll ribosomen i översättning, i varje organism.
Här beskriver vi en enkel metod som kan användas för att rena, exklusivt för analys, som ribosomer översätta ett specifikt mRNA och som innehåller en specifik peptidyl-tRNA 14. Detta förfarande bygger på selektiv isolering av översätta ribosomer bundna till en biotin-märkt mRNA. Dessa translationell komplex separeras från andra ribosomer i samma blandning, med streptavidin paramagnetiska pärlor (SMB) och ett magnetiskt fält (MF). Biotin-märkt mRNA syntetiseras genom avrinning transkription analyser använder som mallar PCR-genererade DNA-fragment som innehåller T7 transkriptionell initiativtagare. T7 RNA-polymeras innehåller biotin-16-UMP från biotin-UTP, under våra förhållanden ungefär tio biotin-16-UMP molekyler ingår i ett 600 NT-mRNA med 25% UMP innehåll. Dessa biotin-märkt mRNA sedan isoleras och används i in vitro översättning analyser utförs med befriande omständighet 2 (RF2)-utfiskade cellfria extrakt från Escherichia coli-stammar som innehåller vild typ eller mutant ribosomer. Ribosomer översätta biotin-märkt mRNA sekvenser stannade vid hållplatsen kodon regionen, på grund av frånvaron av RF2 protein, som normalt utför översättning uppsägning. Stannade ribosomer som innehåller den nyligen syntetiserade peptidyl-tRNA är isolerade och bort från översättningen reaktioner med hjälp av SMB och en MF. Dessa pärlor binder bara biotin innehåller meddelanden.
De isolerade, translationell komplex, kan användas för att analysera de strukturella och funktionella egenskaper hos vildtyp eller mutant ribosomala komponenter eller peptidyl-tRNA sekvenser, samt bestämma ribosomen interaktion med antibiotika eller andra molekylära faktorer 1,14-16. För att undersöka funktionen hos dessa isolerade ribosomen komplex kan peptidyl-transferas analyser göras i närvaro av antibiotika puromycin 1. Att studera strukturella förändringar inom den överbryggande komplex, kan väl inarbetade rutiner användas, till exempel i) crosslinking till specifika aminosyror 14 och / eller ii) alkylering analyser skydd 1,14,17.
Denna isolering förfarande som beskrivs i denna rapport är mycket reproducerbar. Tyvärr kan närvaron av korta peptidyl-tRNAs produceras från det översatta samma sekvenser inte vara lätt undvikas, såsom peptidyl-tRNAs kan motsvara 15-20% av den totala isolerade material (figur 2C). Dessa föroreningar kan öka i koncentration när högre koncentrationer av biotin-märkt mRNA har använts eller när cellfria används extrakt är gamla eller har återanvändas flera gånger. Därför är det mycket viktigt att kontrollera kvaliteten och koncentration av komponenterna i in vitro översättning reaktioner. Alternativt, beredda kommersiella högeffektiva cellfria extrakt finns tillgängliga som kan användas för samma ändamål (PURE-systemet) 18.
Med denna metod är biotin-16-UMP slumpmässigt införlivas längs målet mRNA. Det finns en möjlighet att vissa ORFS innehåller uridin kontrakt kan ha fört in denna modifierad nukleotid i sekvenser, vilket påverkar deras översättning. Variabel relativa koncentrationer av biotin-16-UTP/UTP måste testas under syntesen av mRNA för att få den mest effektiva översättning. Alternativa metoder för biotin märkning kan användas, med inriktning på 5'-änden, den mest stabila slutet av mRNA. (I) Biotin kan fästas i 5'-änden av mRNA med hjälp av 3'-NH2ATP (3'-amino, 3'-deoxyadenosintrifosfat) och T4 RNA ligas 19. (Ii) 5'-änden biotin-märkt oligonukleotid kan fästas i 5'-änden av mRNA med hjälp av T4-RNA-ligas samt 20. (Iii) 3'-änden biotin-märkt oligodeoxynucleotides som motsvarar de komplementära sekvensen vid 5'-änden av mRNA skulle också kunna användas för att isolera översätta komplex. Dessa biotin märkt oligodeoxynucleotides kunde knytas till SMB före isolering. Senare SMB knutna till biotin-märkt oligodeoxynucleotides kunde blandas med översättningen reaktionsblandningen att möjliggöra samverkan med sina kompletterande mRNA-sekvenser. Efter isolering hybriden RNA-DNA-regionen – och regionen hybridisering mellan biotin-märkt oligodeoxynucleotide och mRNA sekvens – skulle brytas ned med hjälp av RNAse H, som skiljer den avstannade komplex från streptavidin pärlor. Denna alternativa metod kan tillåta komplex som ska användas i framtida strukturella analyser med högre upplösning metoder.
The authors have nothing to disclose.
LRC-V. vill ägna denna uppsats till minne av Dr Adriel D. Johnson, en underbar professor vars prioritet nummer ett var alltid utbildning av studenter. Vi saknar dig, Adriel. Vi är tacksamma för att Jacqueline Moreno för hennes hjälp för att utföra de experiment som beskrivs i denna studie. Denna studie stöddes av ett bidrag som ges till CY från National Science Foundation, MCB-0615390, och genom att starta fonder ges till LRC-V. från University of Alabama i Huntsville.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Tris base | Sigma | 252859 | ||
Magnesium acetate | Fluka | 63049 | ||
Potassium glutamate | Sigma | G1501 | ||
Ammonium acetate | Fluka | 09688 | ||
PMSF | Sigma | P7626 | ||
Protein A sepharose 4B slurry beads | Sigma | P9424 | ||
Leupeptin inhibitor | Sigma | L9783 | ||
Taq-DNA polymerase | Stratagene | 201223 | ||
T7 Maxiprep kit | Promega | P1300 | ||
SMB | Promega | Z5482 | ||
Biotin-16-UTP | Roche | 1388908 | ||
ATP | Sigma | A7699 | ||
GTP | Sigma | G8877 | ||
PEP | Sigma | P7002 | ||
PK | Sigma | P7768 | ||
Polyethylenglycol 8000 | Fluka | 81268 | ||
Folinic acid | Fluka | 47612 | ||
Spermidine | Fluka | 85558 | ||
tRNA from E. coli | Sigma | R1753 | ||
DEPC | Sigma | D5758 | ||
Tricine | Sigma | T5816 | ||
L-amino acids | Sigma | LAA21 | ||
DTT | Fluka | 43815 | ||
magnetic separation stands | Promega | Z5342 |