التصوير تغيير الشكل في الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأجنة
Summary
وتتميز التنمية في وقت مبكر من ذبابة الفاكهة ، وذبابة الفاكهة السوداء البطن ، من قبل عدد من التغييرات شكل الخلية التي هي مناسبة تماما للنهج التصوير. هذه المادة سوف تصف الأدوات الأساسية والأساليب اللازمة لتصوير الأجنة الحية مبائر ذبابة الفاكهة ، وستركز على تغيير شكل خلية تسمى cellularization.
Abstract
البلدان النامية الجنين melanogaster ذبابة الفاكهة يخضع لعدد من التغييرات شكل الخلية التي هي قابلة للعيش عالية مبائر التصوير. يتغير شكل خلية في الذبابة هي مشابهة لتلك الموجودة في أعلى الكائنات الحية ، وأنهم يؤدون التشكل الأنسجة. بذلك ، في كثير من الحالات ، دراستهم له تداعيات مباشرة لفهم الأمراض التي تصيب البشر (الجدول 1) 1-5. على النطاق الفرعي الخلوية ، وهذه التغييرات شكل الخلية هي نتاج الأنشطة التي تتراوح بين التعبير الجيني لنقل الإشارة ، قطبية الخلية ، وإعادة تشكيل هيكل الخلية والاتجار الغشاء. وبالتالي ، فإن الجنين ذبابة الفاكهة يوفر ليس فقط في سياق تقييم يتغير شكل الخلية من حيث صلتها التشكل الأنسجة ، ولكن كما يوفر بيئة الفسيولوجية تماما لدراسة الأنشطة الفرعية الخلوية أن الخلايا الشكل.
وصف بروتوكول يهدف الى هنا صورة شكل خلية معينة تسمى cellularization تغيير. Cellularization هو عملية دراماتيكية غشاء البلازما النمو ، ويحول في نهاية المطاف إلى الجنين المخلوي الأريمة الخلوية. وهذا هو ، في الطور البيني من دورة الإنقسامية 14 ، غشاء البلازما invaginates في وقت واحد حول كل من نوى 6000 ~ رست cortically لتوليد ورقة من الخلايا الظهارية الابتدائي. العداد إلى الاقتراحات السابقة ، ليست مدفوعة من قبل الميوسين cellularization انقباض – 2 6 ، ولكن بدلا من ذلك إلى حد كبير وتتغذى بواسطة إيماس من الغشاء الداخلي من مخازن 7. وهكذا ، cellularization هو نظام ممتاز لدراسة الاتجار غشاء الخلية خلال التغييرات التي تتطلب شكل البلازما انغلاف الغشاء أو التوسع ، مثل الحرائك الخلوية أو عرضية – نبيب (T – نبيب) التشكل في العضلات.
علما بأن يتم تطبيق هذا البروتوكول بسهولة إلى التصوير من تغييرات أخرى في شكل خلية الجنين يطير ، ويتطلب تعديلات طفيفة فقط مثل تغيير مرحلة جمع الجنين ، أو باستخدام "الغراء الجنين" لتحميل الجنين في اتجاه معين (الجدول 1) 19/08. في جميع الحالات ، وسير العمل في الأساس نفسه (الشكل 1). وتستخدم الأساليب الموحدة لاستنساخ وtransgenesis ذبابة الفاكهة لإعداد مخزونات يطير المستقرة التي تعبر عن البروتين من الفائدة ، وتنصهر لبروتين الفلورية الخضراء (GFP) أو مشتقاته ، وهذه الذباب توفير مصدر متجدد للأجنة. بدلا من ذلك ، يتم تقديمها مباشرة البروتينات الفلورية / تحقيقات في الأجنة تطير مباشرة عبر الحقن التقنيات المتناهية الصغر 9-10. ثم ، اعتمادا على الحدث التنموية وتغيير شكل خلية ليمكن تصوير ، يتم جمع الأجنة والتي قام بها التشكل على مجهر تشريح ، والمتمركزة في النهاية ومنصة لمرور الزمن على التصوير مبائر المجهر.
Protocol
Discussion
وصف بروتوكول هنا سوف تسمح للعيش ، والتصوير مبائر عدد من التغييرات شكل خلية في جنين ذبابة النامية. يمكن أن تكون على استعداد لتصوير GFP الأسهم من قبل مختبر الفردية (الجدول 2) ، ولكن العديد من هذه الأسهم هي أيضا متاحة للجمهور من مراكز مثل مركز ألبوم بلومينغتون ذبابة الفا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف بامتنان اريك Wieschaus ، الذين قدموا الأساس الذي وضعت هذا البروتوكول. ويدعم عملنا في وزارة ماكلين فيرنا Marrs والكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية البدء الجائزة ، كلية بايلور للطب.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Slides | Fisherbrand/Fisher Scientific | 12-550-343 | ||
| Cover slips 25×25 | Fisher Scientific (Corning #2865-25) | 1 2-524C | ||
| Squirt bottles (H2O) | Fisher Scientific | 02-897-11 | ||
| 50 ml Falcon tubes | Fisher Scientific (BD# 352070) | 14-432-22 | ||
| Bulbs for small pipets, 1 mL | Fisherbrand/Fisher Scientific | 03-448-21 | ||
| Scintillation vials with caps | VWR (Wheaton #986546) | 66021-533 | ||
| Tri-Corn Beakers, 100 mL | Electron Microscopy Sciences | 60970 | ||
| BD Falcon Petri dish 60x15mm | Fisher Scientific (BD# 351007) | 08757 100B | ||
| BD Falcon Cell strainer | Fisher Scientific (BD#352350) | 08-771-2 | ||
| Yellow pipet tips | Ranin | L200 | ||
| Stainless steel mesh, 304, 12×24 | Small Parts | CX-0150-F-01 | ||
| Glass 5¾ inch Pasteur Pipets | Fisherbrand/Fisher Scientific | 13-678-20B | ||
| P4 Filter paper | Fisherbrand/Fisher Scientific | 09-803-6F | ||
| Rubber bands | Office Max | A620645 | ||
| Scotch double-sided tape, ½ inch | Office Max | A8137DM-2 | ||
| Robert Simmons Expression paint brushes E85 round #2 | Jerry’s Artarama | 56460 | ||
| Dumont #5 Forceps High Precision Inox | Electron Microscopy Services | 72701-DZ | ||
| Razor blades | VWR (BD #214010) | 55411-050 | ||
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | H 8773 | ||
| Heptane | Fisher Chemical/Fisher Scientific | H360-1 | ||
| BD Bacto Agar | VWR (BD# 214010) | 90000-760 | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S7903 | ||
| p-Hydroxybenzoic acid | Sigma-Aldrich | H5501 | ||
| Red Star Active Dry Yeast | LeSaffre | 15700 | ||
| Paper towels, C-fold | Kleenex | |||
| Heavy duty aluminum foil | Reynolds Wrap | |||
| Bleach | Austin’s A-1 Commercial | |||
| 100% Apple juice | Ocean Spray or Tree Top |
References
- Sagona, A. P., Stenmark, H. Cytokinesis and cancer. FEBS Lett. 584, 2652-2661 (2010).
- Baum, B., Settleman, J., Quinlan, M. P. Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease. Semin Cell Dev Biol. 19, 294-308 (2008).
- Kibar, Z., Capra, V., Gros, P. Toward understanding the genetic basis of neural tube defects. Clin Genet. 71, 295-310 (2007).
- Jazwinska, A., Ribeiro, C., Affolter, M. Epithelial tube morphogenesis during Drosophila tracheal development requires Piopio, a luminal ZP protein. Nat Cell Biol. 5, 895-901 (2003).
- Martin, P., Parkhurst, S. M. Parallels between tissue repair and embryo morphogenesis. Development. 131, 3021-3034 (2004).
- Royou, A., Field, C., Sisson, J. C., Sullivan, W., Karess, R. Reassessing the role and dynamics of nonmuscle myosin II during furrow formation in early Drosophila embryos. Mol Biol Cell. 15, 838-850 (2004).
- Lecuit, T., Wieschaus, E. Polarized insertion of new membrane from a cytoplasmic reservoir during cleavage of the Drosophila embryo. J Cell Biol. 150, 849-860 (2000).
- Mavrakis, M., Rikhy, R., Lippincott-Schwartz, J. Plasma membrane polarity and compartmentalization are established before cellularization in the fly embryo. Dev Cell. 16, 93-104 (2009).
- Cao, J., Crest, J., Fasulo, B., Sullivan, W. Cortical Actin Dynamics Facilitate Early-Stage Centrosome Separation. Curr Biol. , (2010).
- Cao, J., Albertson, R., Riggs, B., Field, C. M., Sullivan, W. N. u. f. a Rab11 effector, maintains cytokinetic furrow integrity by promoting local actin polymerization. J Cell Biol. 182, 301-313 (2008).
- Sokac, A. M., Wieschaus, E. Local actin-dependent endocytosis is zygotically controlled to initiate Drosophila cellularization. Dev Cell. 14, 775-786 (2008).
- Fox, D. T., Peifer, M. Abelson kinase (Abl) and RhoGEF2 regulate actin organization during cell constriction in Drosophila. Development. 134, 567-578 (2007).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin-myosin network drive apical constriction. Nature. 457, 495-499 (2009).
- Bertet, C., Sulak, L., Lecuit, T. Myosin-dependent junction remodelling controls planar cell intercalation and axis elongation. Nature. 429, 667-671 (2004).
- Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis. Dev Cell. 11, 459-470 (2006).
- Caussinus, E., Colombelli, J., Affolter, M. Tip-cell migration controls stalk-cell intercalation during Drosophila tracheal tube elongation. Curr Biol. 18, 1727-1734 (2008).
- Gervais, L., Casanova, J. In vivo coupling of cell elongation and lumen formation in a single cell. Curr Biol. 20, 359-366 (2010).
- Gorfinkiel, N., Blanchard, G. B., Adams, R. J., Arias, M. a. r. t. i. n. e. z., A, . Mechanical control of global cell behaviour during dorsal closure in Drosophila. Development. 136, 1889-1898 (2009).
- Solon, J., Kaya-Copur, A., Colombelli, J., Brunner, D. Pulsed forces timed by a ratchet-like mechanism drive directed tissue movement during dorsal closure. Cell. 137, 1331-1342 (2009).
- Bownes, M. A photographic study of development in the living embryo of Drosophila melanogaster. J Embryol Exp Morphol. 33, 789-801 (1975).
- Sokac, A. M., Wieschaus, E. Zygotically controlled F-actin establishes cortical compartments to stabilize furrows during Drosophila cellularization. J Cell Sci. 121, 1815-1824 (2008).
- Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 15050-15055 (2001).
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. J Cell Sci. 114, 493-501 (2001).
- Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila. J Cell Biol. 149, 471-490 (2000).
