में परख लोकोमोटर, सीखना, और स्मृति घाटे ड्रोसोफिला Neurodegeneration के मॉडल

Summary

हरकत कार्यों को मापने, सीखने के लिए व्यवहार assays, और स्मृति क्षमताओं<em> ड्रोसोफिला</em>.

Abstract

आनुवंशिक तरीकों में अग्रिम मानव neurodegenerative रोगों में एक मॉडल ¹ प्रणाली के रूप में ड्रोसोफिला का उपयोग शामिल जीनों का अध्ययन सक्षम है . अल्जाइमर, पार्किंसंस और Huntington रोग सहित इन रोगों के अधिकांश सीखने और स्मृति कार्यों और आंदोलन समन्वय ² में उम्र पर निर्भर गिरावट द्वारा विशेषता है. यहाँ हम नकारात्मक geotaxis ³ परख और aversive phototaxic दमन के (ए पी एस परख) ^परख 4,5 सहित व्यवहार assays, का उपयोग करने के लिए दिखाने के लिए है कि मानव neurodegeneration के साथ जुड़े व्यवहार विशेषताओं के कुछ मक्खियों में recapitulated किया जा सकता है. नकारात्मक geotaxis परख में, की स्वाभाविक प्रवृत्ति के गुरुत्वाकर्षण के खिलाफ कदम जब उत्तेजित करने के लिए जीन या स्थिति है कि हरकत क्षमता में बाधा कर सकते हैं अध्ययन के लिए उपयोग किया जाता है मक्खियों. ए पी एस परख में, सीखने और स्मृति कार्यों सकारात्मक phototactic में परीक्षण कर रहे हैं aversive कड़वा स्वाद के साथ प्रकाश सहयोगी और इसलिए इस अन्यथा स्वाभाविक प्रवृत्ति से बचने के लिए प्रकाश की ओर कदम प्रशिक्षित मक्खियों. इन प्रशिक्षित परीक्षण मक्खियों 6 घंटे के बाद प्रशिक्षण के लिए स्मृति कार्यों का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इन assays का उपयोग, विकासशील neurodegeneration की ओर किसी भी आनुवंशिक या पर्यावरणीय कारकों के योगदान को आसानी से मक्खियों में अध्ययन किया जा सकता है.

Protocol

1. परिचय इस वीडियो में, हम दो व्यवहार ड्रोसोफिला का उपयोग करने के लिए हरकत और सीखने और स्मृति कार्यों कि neurodegenerative विकारों में समझौता कर रहे हैं की माप प्रदर्शित assays के प्रदर्शन करेंगे. सबसे पहले, हम दिखा देंगे कि कैसे हरकत व्यवहार नकारात्मक geotaxis परख का उपयोग कर मापा जा सकता है है. दूसरा, हम है कि एक aversive कड़वा स्वाद के साथ प्रकाश सहयोगी करने के लिए प्रशिक्षित कर रहे हैं और फिर 6 घंटे बाद परीक्षण के लिए स्मृति कार्यों का आकलन सकारात्मक phototactic मक्खियों का उपयोग सीखने और स्मृति क्षमताओं का आकलन करेंगे. अंत में, हम इन व्यवहार assays के निहितार्थ और सीमाओं पर चर्चा करेंगे. 2. उपकरण और अभिकर्मकों काम फ्लाई स्टीरियो गुंजाइश (Zeiss) मक्खियों धकेलने के लिए लघु पेंट ब्रश ड्रोसोफिला कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ 2) संज्ञाहरण तंत्र (Geneseesci इंक) नकारात्मक Geotaxis परख 28.5 x 95 मिमी Polystyrene शीशी (कैपिटल शीशी इंक,) मिनी अलार्म टाइमर / स्टॉपवॉच (VWR अंतर्राष्ट्रीय) Sharpie कलम चिपकने वाला टेप Aversive Phototaxis दमन परख कुनैन हाइड्रोक्लोराइड (सिग्मा Aldrich, कैस संख्या: 6119-47-7) आसुत जल वजन द्वारा डिजिटल सटीक कमजोर पड़ने के लिए मापने के पैमाने त्वरित डिस्कनेक्ट कनेक्टर्स, उच्च घनत्व Polyethylene (Nalgene VWR सूचि सं 62868-021) 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब (VWR इंटरनेशनल), बंद अंत से 2 एमएल निशान पर कटौती के प्रकाश स्रोत के लिए त्वरित डिस्कनेक्ट कनेक्टर एडाप्टर के साथ फिट एकल चैनल 200 μL फिल्टर कक्ष अस्तर कागज पर कुनैन समाधान लोड pipetter टी भूलभुलैया (सरल व्यवहार सिस्टम, चित्रा 1) एल्यूमिनियम पर्ण प्रकाश स्रोत (Zeiss) लाल बत्ती के साथ एक चिराग. फिल्टर पेपर मिनी अलार्म टाइमर / स्टॉपवॉच (VWR अंतर्राष्ट्रीय) 3. मक्खियों की तैयारी मक्खियों मानक मध्यम cornmeal के अगर – गुड़ – खमीर पर 25 में रखा जाता है डिग्री सेल्सियस 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र पर. वर्जिन मक्खियों eclosion के दिन पर कार्बन डाइऑक्साइड संज्ञाहरण के तहत अलग कर रहे हैं. उम्र बढ़ने अध्ययन के लिए, मक्खियों शीशी प्रति बीस के समूह में रखा जाता है और एक ताजा शीशी को हस्तांतरित हर 3 दिन. यह महत्वपूर्ण है उम्र बढ़ने अध्ययन के लिए एक ही माता पिता के पार से भाई मक्खियों का उपयोग करने के लिए, आनुवंशिक पृष्ठभूमि से उत्पन्न होने वाले मतभेदों को कम करने. दोनों assays के लिए, मक्खियों sexed हैं और शीशी प्रति दस मक्खियों के समूह में बनाए रखा. व्यवहार पर लिंग अंतर महत्वपूर्ण है और यह सलाह दी जाती है एक अध्ययन में नर और मादा मक्खियों को नहीं मिश्रण के रूप में डेटा व्याख्या और पुन: पेश 6 मुश्किल हो सकता है . नकारात्मक geotaxis परख के लिए, मक्खियों शीशी प्रति दस के समूहों में हल कर रहे हैं और संज्ञाहरण के बाद एक घंटे का परीक्षण किया. यह महत्वपूर्ण है के लिए पूरी तरह मक्खियों संज्ञाहरण से उबरने के रूप में इस हरकत गतिविधियों पर एक प्रभाव हो सकता है. ए पी एस परख के लिए, प्रत्येक समूह के मक्खियों पानी के साथ एक खाली polystyrene शीशी में छह घंटे के लिए फिल्टर पेपर रखा जाता है सिक्त पहले परख प्रदर्शन किया है. यह सुनिश्चित करता है कि मक्खियों परख पहले भूखे हैं और अधिक aversive स्वाद के लिए बोधगम्य हो जाएगा. बस से पहले परख प्रदर्शन किया है, दस के एक समूह से प्रत्येक मक्खी एक खाली 15ml अपकेंद्रित्र ट्यूब, जो तब शिथिल छाया हुआ है, भागने से बचने में रखा गया है. 4. नकारात्मक Geotaxis परख Geotaxis वही जीनोटाइप या उपचार (1-200 प्रत्येक जीनोटाइप / उपचार के लिए कुल मक्खियों) 7 के दस व्यक्तियों के दस से बीस समूहों के लिए आम तौर पर मापा जाता है. सीओ 2 संज्ञाहरण तंत्र और एक अलग शीशी में जगह प्रत्येक समूह पर दस महिला या पुरुष मक्खियों के आधार पर छाँटें समूहों. मक्खियों संज्ञाहरण से उबरने के लिए कम से कम एक घंटे की अनुमति दें. प्रत्येक समूह के लिए चढ़ाई तंत्र, ऐसी है कि दो खाली polystyrene शीशियों खड़ी टेप से जुड़े हुए एक दूसरे का सामना कर रहे हैं तैयार. यह महत्वपूर्ण है यकीन है कि शीशियों के उद्घाटन पूरी तरह से एक दूसरे के साथ गठबंधन कर रहे हैं मक्खियों के लिए एक भी चढ़ाई सतह प्रदान करने है. कम शीशी के लिए, नीचे की सतह से ऊपर 8 सेमी का एक ऊर्ध्वाधर दूरी को मापने के लिए और प्रत्येक शीशी शीशी के पूरे परिधि के चारों ओर एक घेरे के ड्राइंग द्वारा निशान. कम ध्यान से किसी भी मक्खी के भागने को रोकने शीशी में दस मक्खियों के एक समूह का स्थानांतरण. तुरंत ऊपर और संपर्क के उद्घाटन के पास सुरक्षित शीशी टेप के साथ कम शीशी को कवर. मक्खियों परख आयोजन से पहले 1 मिनट के लिए नए स्थापित करने के लिए acclimatize करने के लिए अनुमति दें. धीरे मक्खियों नल नीचे शीशी के नीचे और मक्खियों कि नल के बाद 10 सेकंड से 8 सेमी चिह्न ऊपर चढ़ाई कर सकते हैं की संख्या को मापने. एक ही समूह में दस बार के लिए इस परख दोहराएँ, प्रत्येक परीक्षण के बीच एक मिनट बाकी अवधि के लिए अनुमति देता है. समूह प्रति मक्खियों की संख्या है कि एक के रूप में 8 सेमी निशान पारित रिकार्डकुल मक्खियों का प्रतिशत. 5. Aversive Phototaxis दमन परख (ए पी परख) मूलतः Le Bourg और Buecher 4 (2002) से अनुकूलित, इस परख मक्खियों में सकारात्मक phototactic व्यवहार कारनामे के लिए उन्हें प्रशिक्षित aversive उत्तेजनाओं (इस मामले में, कुनैन का कड़वा स्वाद में) के साथ प्रकाश सहयोगी . एक चरण / प्रशिक्षण कंडीशनिंग के बाद, जंगली प्रकार मक्खियों aversive स्वाद के साथ रोशन क्षेत्र सहयोगी और इसे से बचने के लिए सक्षम हो जाएगा. समझौता सीखने की क्षमता के साथ मक्खियों इस संघ बनाने के लिए असफल हो जायेगी. इसके अलावा, ए पी एस परख भी अल्पकालिक स्मृति के समारोह को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है एक ही परीक्षण के 6 घंटे के बाद कंडीशनिंग के लिए पहले से ही प्रशिक्षित मक्खियों subjecting सीखा काम याद में उनकी क्षमता का परीक्षण द्वारा 5 मक्खियों. क़ुनैन समाधान की तैयारी आसुत जल में कुनैन हाइड्रोक्लोराइड भंग 0.1M शेयर समाधान (50ml आसुत जल में 1.98g). शेयर समाधान -20 डिग्री सेल्सियस पर रखा जा सकता है के लिए एक साल के लिए छोटे aliquots में आसुत जल में शेयर समाधान गिराए द्वारा 1 सुक्ष्ममापी की एक काम समाधान तैयार करें. टी भूलभुलैया तैयारी टी भूलभुलैया जाल दरवाजा और दो स्वतंत्र कक्षों, एक "अंधेरे" कक्ष और एक "रोशन" कक्ष (चित्रा 1) के साथ केंद्र स्तंभ के होते हैं. चैंबर की तैयारी: दो 15ml प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूबों ले और नीचे से 2 एमएल निशान पर कटौती एक मैनुअल के साथ अंत बंद देखा. प्रत्येक के अंत में संबंधक एडेप्टर फ़िट, और parafilm के साथ संबंध सील. ट्यूब के अंत में एडाप्टर gooseneck प्रकाश स्रोत के लिए इनपुट स्लॉट के रूप में कार्य करता है. प्रकाश स्रोत के साथ एक ट्यूब कनेक्ट और इस ट्यूब "रोशन" चैम्बर हो जाएगा. लपेटें एल्यूमीनियम पन्नी के साथ अन्य ट्यूब "अंधेरे" चैम्बर के रूप में सेवा. या तो आसुत जल या कुनैन समाधान प्रकाश के चैम्बर में कागज और जगह फिल्टर 180uL जोड़ें. केंद्र स्तंभ के प्रत्येक पक्ष पर पंगा लेना रोशन और अंधेरे कक्षों के बीच बंद (चित्रा 1) में जाल दरवाजे के साथ टी भूलभुलैया, इकट्ठे. रोशन चेंबर में प्रकाश स्रोत डालें. प्रशिक्षण aversive उत्तेजनाओं के साथ phototaxis को दबाने के लिए मक्खियों खोल देना टी भूलभुलैया से अंधेरे कक्ष और इस चेंबर में एक एकल मक्खी हस्तांतरण और तुरंत भूलभुलैया अंधेरे ट्यूब वापस पेंच. बंद कमरे में रोशनी मुड़ें और लाल दीपक पर बारी. मक्खी 30 सेकंड के लिए अंधेरे कक्ष में acclimatize करने के लिए और धीरे धीरे प्रकाश स्रोत रोशन रोशन कक्ष पर बारी करने की अनुमति दें. धीरे धीरे जाल दरवाजा है कि दो कक्षों अलग खोलने. यदि मक्खी 10 सेकंड के भीतर प्रकाशित कक्ष में चलता है, यह सकारात्मक phototactic माना जाता है और परख के लिए प्रशिक्षित किया जा तैयार है. Phototaxis में विफलता दृश्य प्रणाली में समस्याओं को इंगित करता है और मक्खियों के साथ नकारात्मक phototaxis परख से बाहर होने की जरूरत है. Aversive Phototaxis दमन प्रशिक्षण (ए पी एस) के लिए, मक्खी कि सकारात्मक phototaxis प्रदर्शन वापस अंधेरे कक्ष में नल, जाल दरवाजा बंद और बत्ती बारी है. Acclimatizing के 30 सेकंड की अनुमति दें. इस समय के दौरान कुनैन समाधान के साथ रोशन कक्ष में फिल्टर पेपर रखा. धीरे – धीरे जाल दरवाजा खुला और प्रकाश पर बारी. कुनैन लेपित रोशन कक्ष में उड़ चलने की अनुमति दें. एक मिनट के बाद, वापस उड़ और अंधेरे कक्ष में नल इस 9 गुना अधिक दोहराएँ. (आमतौर पर, जंगली प्रकार 3 से 5 प्रशिक्षण परीक्षण के बाद प्रकाशित चैम्बर से बचने मक्खियों.) प्रशिक्षण के बाद तुरंत, पांच परीक्षण परीक्षण आयोजित किया जाएगा. प्रत्येक परीक्षण परीक्षण में अनुमति है, 10 सेकंड के बाद प्रकाश पर प्रशिक्षित करने के लिए प्रकाशित चैम्बर चलना मक्खी के लिए चालू है. रोशन शीशी चलना विफलता "पास", जो "सुदृढीकरण के माध्यम से सीखा कार्य" बराबर है के रूप में दर्ज किया जाएगा. लगातार पांच परीक्षणों पर दर्रा दर दर्ज की है और PC0 (0 घंटा पोस्ट कंडीशनिंग) के रूप में चित्रा 2 में नीचे दिखाया गया है. मक्खियों में लघु अवधि के स्मृति समारोह का आकलन प्रशिक्षण और प्रारंभिक PC0 रिकॉर्डिंग के बाद, प्रत्येक मक्खी वापस अपने मूल भोजन शीशी में रखा गया है और छह घंटे के लिए अलग रखा. छह घंटे के बाद प्रशिक्षण, पहले के रूप में एक ही रास्ते में 5 फिर से परीक्षण करने के लिए प्रत्येक मक्खी विषय, और बार की संख्या रिकॉर्ड मक्खी (गुजारें) से बचा जाता है या में चला जाता है (विफल) प्रकाशित शीशी. इस गुजारें दर PC6 (6 बजे पोस्ट कंडीशनिंग), जो अल्पकालिक स्मृति का एक संकेतक है के रूप में दर्ज है. 6. डेटा व्याख्या और सांख्यिकीय विश्लेषण नकारात्मक Geotaxis परख इस परख से कच्चे डेटा उत्पन्न 10 सेकंड में प्रत्येक समूह में 8 सेमी निशान पार मक्खियों की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है. प्रतिशत करने के लिए इस कनवर्ट करना और प्रत्येक समूह के लिए 10 सत्रों में औसत से गुजारें दर की गणना. डेटा रेखांकन समूह के प्रति एक औसत से गुजारें मतलब की मानक त्रुटि (SEM) के साथ दर (जीनोटाइप, उपचार आदि) के रूप में प्रतिनिधित्व किया है. समूहों के बीच अंतरतब सांख्यिकीय महत्वपूर्ण है या का उपयोग करते हुए एक छात्र टी परीक्षण या एनोवा नहीं हो निर्धारित किया जा सकता है. Aversive Phototaxis दमन परख इस परख से कच्चे डेटा बार की संख्या प्रत्येक मक्खी लगातार पांच परीक्षणों में प्रकाशित कक्ष से बचा जाता है के रूप में प्रतिनिधित्व किया है. गुजारें दर कुल परीक्षणों में सफल परिहार परीक्षण के प्रतिशत के रूप में गणना की है. समूह 15 प्रति मक्खियों की एक न्यूनतम के लिए इस तरीके में औसत पास दर की गणना. या औसत से गुजारें दर (6 घंटे पोस्ट कंडीशनिंग, "स्मृति" संकेतक) PC6 संबंधित SEM के साथ, डेटा रेखांकन औसत गुजारें PC0 दर ("सीखने" सूचक तुरंत कंडीशनिंग के बाद) के रूप में प्रतिनिधित्व किया है. सीखना और स्मृति सूचकांक दोनों जंगली प्रकार और "आनुवंशिक रूप से छेड़छाड़ सौम्य" उचित समूह (जैसे GFP overexpressing मक्खियों) के साथ समूहों के बीच तुलना कर रहे हैं. 7. प्रतिनिधि परिणाम इस वीडियो के प्रयोग में, हम केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में मक्खियों overexpressing मानव ताउ में सीखने और स्मृति और मोटर घाटे का आकलन कर रहे हैं और मक्खियों overexpressing GFP के उन लोगों के लिए उनके प्रदर्शन की तुलना. ड्रोसोफिला में मानव ताउ की neuronal overexpression 8 मस्तिष्क में गंभीर vacuolization कारण और सीखने और स्मृति 9 कार्यों में महत्वपूर्ण घाटे के लिए नेतृत्व करने के लिए दिखाया गया है. 2A चित्र में दिखाया गया है, 10 दिन पुराने नर या मादा मक्खियों overexpressing मानव ताउ उम्र से मिलान GFP overexpressing तुलना में महत्वपूर्ण हरकत का घाटा है मक्खियों. इसके अलावा, इन मक्खियों प्रकाश कड़वा स्वाद के साथ सहयोगी के रूप में नियंत्रण समूह की तुलना में PC0 पास दर से दिखाया विफल रहा है, के रूप में अच्छी तरह के रूप में PC6 गुजारें दर (चित्रा 2B) में गिरावट के द्वारा दिखाया के रूप में इस संघ को याद करने में विफल. इस प्रयोग को आगे पुष्टि है कि ड्रोसोफिला मॉडल मानव neurodegenerative शर्तों का अध्ययन और व्यवहार मानव और स्तनधारियों में मनाया phenotypes के कुछ recapitulating के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. चित्रा 1. Aversive Phototaxis दमन परख के लिए सेटअप टी भूलभुलैया ए . प्रकाश "रोशन बाज़" ट्यूब, फिल्टर और बाएँ (पन्नी में कवर) पर "अंधेरे" ट्यूब कागज के साथ लाइन, एक जाल दरवाजा द्वारा अलग से जुड़े स्रोत के साथ APSA प्रयोग के लिए समग्र प्रयोगात्मक सेटअप. बी प्रशिक्षण और परीक्षण के चरण के दौरान, मक्खी अंधेरे कक्ष में है और जाल दरवाजा खोला के बाद प्रकाश पर प्रकाशित कक्ष में चालू है. चित्रा 2. प्रतिनिधि नकारात्मक geotaxis और ए पी एस प्रयोग का उपयोग करने से परिणाम एक अखिल neuronal ड्राइवर के साथ overexpressing GFP या ताउ मक्खियों ए . नकारात्मक geotaxis परख में, 10 दिन पुराने नर (नीले स्तंभ) या महिला (लाल स्तंभ) मक्खियों overexpressing GFP उच्च चढ़ाई गतिविधि की तुलना में ताउ overexpressing मक्खियों से पता चला है. बी 20 दिन पुरानी मादा मक्खियों overexpressing GFP बेहतर (PC0) सीखने और स्मृति से पता चला है (PC6) कार्यों ताउ overexpressing मक्खियों से.

Discussion

दोनों नकारात्मक geotaxis और ए पी एस assays हरकत या सीखने और स्मृति क्षमता आनुवंशिक या पर्यावरणीय हेरफेर से उत्पन्न होने वाली में परिवर्तन को मापने के लिए मजबूत व्यवहार assays हैं. हालांकि, वहाँ इन assays कि आगे अनुकूलन का इंतजार करने के लिए कुछ नुकसान कर रहे हैं.

नकारात्मक geotaxis परख में कुछ जीनों में परिवर्तन मक्खियों में गंभीर मोटर dysfunctions सौंपनेवाला कर सकते हैं. ऐसे मामलों में, मक्खियों शायद ही आंदोलन पर गुरुत्वाकर्षण के जवाब में दीवारों चढ़ाई कर सकते हैं. अन्य व्यवहार assays कि सीधे आंदोलन को मापने अधिक उपयुक्त हो सकता है. ये assays को ठीक पलटा व्यवहार है कि पक्षाघात ^और 10 जब्ती, और optomotor ^{व्यवहार} 11 कि आंदोलन समन्वय के नुकसान रिकॉर्ड के उपाय शामिल हैं.

ए पी एस परख में, पहली बाधा बेतरतीब ढंग से आगे बढ़ने के बिना रोशन कक्ष के द्वार पर रोक मक्खियों किया जा सकता है. यह एक मुद्दे के अधिक हो जाता है कि उम्र बढ़ने अध्ययन शर्तों में से एक है, के बाद से बड़े मक्खियों कम सामान्य में सक्रिय हैं और रोकने के लिए और समय की लंबी अवधि के लिए आराम करते हैं. इस मामले में experimenter यांत्रिक उत्तेजनाओं प्रदान करने के लिए आंदोलन है, जो हमेशा प्रभावी नहीं है को बढ़ावा देने है. दूसरा, एक बहस सकता है कि विफलता के लिए सकारात्मक phototaxis का एक नुकसान से रोशन चैम्बर परिणामों को जाने. यह शायद ही मामला है, क्योंकि पिछले काम दिखाया गया है कि मक्खियों प्रकाश जवाबदेही वापस बारी एक बार सुदृढ़ ^{नकारात्मक} 4 हटा दिया जाता है . तीसरा, aversive उत्तेजना के साथ संपर्क की अवधि के परीक्षण से परीक्षण करने के लिए भिन्न हो सकते हैं. यह भिन्नता आमतौर पर लथपथ फिल्टर पेपर के साथ कक्ष के भीतरी दीवार encircling कुनैन से बचने मक्खियों से रोकने के द्वारा कम किया जा सकता है. इसके अलावा, experimenter सुनिश्चित कर सकते हैं कि प्रत्येक मक्खी अन्यथा नोट 1 मिनट से कक्ष में बिताए समय की राशि को बढ़ाने के द्वारा फिल्टर पेपर के साथ संपर्क में काफी समय खर्च करते हैं.

सारांश में, नकारात्मक geotaxis और ए पी एस assays के व्यवहार घाटे का आकलन करने के तेज और आसान तरीके हैं और मात्रात्मक हरकत और ड्रोसोफिला में सीखने और स्मृति क्षमताओं से संकेत मिलता है. ये assays ड्रोसोफिला में मानव neurodegenerative शर्तों के मॉडलिंग में विशेष रूप से उपयोगी हैं.

Materials

Materials	Company	Catalog Number	Comment
Polystyrene Vial	Capitol Vial, Inc.	28Fly	28.5 x 95 mm Polystyrene Vial; material quality important, bad if too slippery for flies to climb.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	000000-1432-979	2 branches goose-neck light guide (12V/30W)
Quinine Hydrochloride	Sigma Aldrich	6119-47-7	Dissolve in distilled water.
Quick Disconnect Connectors	Nalgene (VWR)	62868-021	High-Density Polyethylene
T-Maze	Simple Behavioral Systems
Single-channel 200 μL pipette	Eppendorf	022443305