Sf9 कक्ष में और Aplysia संवेदी न्यूरॉन्स में PKC स्थानान्तरण के लाइव इमेजिंग
Summary
इस वीडियो में, हम रहने वाले fluorescently टैग PKCS का उपयोग कर कक्षों में PKC स्थानान्तरण के दृश्य प्रदर्शित करता है.
Abstract
प्रोटीन kinase Cs (PKCS) threonine kinases है कि सेल के विकास और सीखने और स्मृति के रूप में सेलुलर प्रक्रियाओं की एक विस्तृत विविधता को विनियमित करने में एक केंद्रीय भूमिका निभा सेरीन हैं. PKC isoforms की रीढ़ में चार ज्ञात परिवारों हैं: शास्त्रीय PKCS (α, βI, βII और γ), उपन्यास प्रकार मैं PKCS (ε और η), उपन्यास प्रकार द्वितीय पीकेसीएस (δ और θ), और atypical (PKCS ζ और ι ). शास्त्रीय PKCS Ca 2 द्वारा सक्रिय कर रहे हैं + और (DAG) diacylclycerol, जबकि उपन्यास PKCS DAG द्वारा सक्रिय कर रहे हैं, लेकिन 2 Ca + स्वतंत्र हैं . atypical PKCS न तो + न ही DAG 2 Ca द्वारा सक्रिय कर रहे हैं. Aplysia californica में, हमारे मॉडल प्रणाली स्मृति गठन का अध्ययन, वहाँ तीन तंत्रिका तंत्र विशिष्ट PKC प्रत्येक प्रमुख वर्ग से isoforms, अर्थात् पारंपरिक PKC एपीएल मैं, उपन्यास प्रकार मैं PKC एपीएल द्वितीय और atypical PKC एपीएल III हैं . PKCS kinases लिपिड सक्रिय हैं और इस प्रकार कोशिकी संकेतों के जवाब में शास्त्रीय और उपन्यास PKCS के सक्रियण अक्सर cytoplasm से प्लाज्मा झिल्ली PKC स्थानान्तरण के साथ सहसंबद्ध किया गया है. इसलिए, जीवित कोशिकाओं में वास्तविक समय में PKC स्थानान्तरण visualizing संकेत पारगमन मार्ग है कि PKC सक्रियण के लिए नेतृत्व elucidating के लिए एक अमूल्य उपकरण बन गया है. उदाहरण के लिए, इस तकनीक के लिए हमें की अनुमति दी गई है स्थापित करने के लिए है कि PKC के अलग isoforms अलग अलग परिस्थितियों में टसकाना synaptic plasticity के विशिष्ट प्रकार मध्यस्थता और PKC एपीएल द्वितीय की है कि serotonin सक्रियण (5HT) के लिए दोनों DAG और phosphatidic एसिड (PA) के उत्पादन की आवश्यकता है 1-2 स्थानान्तरण. महत्वपूर्ण बात, एक न्यूरॉन ही कल्पना करने की क्षमता को बार – बार हमें, उदाहरण के लिए, उत्तम विस्तार में 3 PKC प्रतिक्रिया की desensitization को मापने के लिए अनुमति दी गई है. इस वीडियो में, हम Sf9 सेल संस्कृतियों की तैयारी के हर कदम का प्रदर्शन, एक और वीडियो 4 लेख में Aplysia संवेदी न्यूरॉन्स की संस्कृतियों में वर्णित किया गया है, के जवाब में Sf9 कोशिकाओं में और Aplysia संवेदी न्यूरॉन्स और PKC स्थानान्तरण के रहते इमेजिंग में fluorescently टैग PKCS व्यक्त अलग लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी का उपयोग activators.
Protocol
Discussion
हम fluorescently टैग PKCS की छवि स्थानान्तरण करने के लिए एक तकनीक का वर्णन है Sf9 कोशिकाओं में और Aplysia संवेदी न्यूरॉन्स में वास्तविक समय में. Sf9 कोशिकाओं छवि PKC स्थानान्तरण करने के लिए एक सरल प्रणाली प्रदान करते हैं ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान अनुदान (CIHR) की वेन एस Sossin के लिए संस्थान द्वारा समर्थित किया गया था. कैरोल ए फराह डे ला Fonds Recherche एन SANTE डु (FRSQ) क्यूबेक और कॉनरोड Harrington फैलोशिप से एक postdoctoral फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है. लेखकों वीडियो और ग्राफिक सिंहावलोकन के साथ मदद के लिए मेडलिन रिचमंड पूल शूट के साथ मदद के लिए Joanna बत्ती, मार्गरेट हेस्टिंग्स और मार्गरेट Labban धन्यवाद देना चाहूंगा.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sf9 frozen cells | Spodoptera frugiperda ovarian cells | Invitrogen | B825-01 | |
| Grace’s Insect Medium, Supplemented (1X), liquid | Reagent | Gibco | 11605-094 | Use to culture Sf9 cells |
| Corning 75cm2 canted neck cell culture flask | Tool | Corning | 430720 | Use to culture Sf9 cells |
| Fetal Bovine Serum | Reagent | CanSera | CS-C08-500 | Supplement Grace’s media with FBS prior to use |
| Syringe | Tool | Becton Dickinson | 309604 | Use to filter Fast Green solution |
| Syringe | Tool | Becton Dickinson | 309602 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431229 | Use to filter Fast Green solution |
| Filter | Tool | Corning | 431212 | Use to filter plasmid DNA / Fast Green solution |
| Glass Bottom Dish | Tool | Mattek | P35G-1.5-14-C | Use to culture Sf9 cells prior to transfection and imaging |
| Cellfectin II Reagent | Reagent | Invitrogen | 10362-100 | Used to express fluorescently tagged PKCs in Sf9 cells |
| Fast Green FCF | Reagent | Sigma-Aldrich | F-7252 | Use to visualize microinjection of plasmid DNA solution into Aplysia sensory neurons |
| Thin wall glass capillaries | Tool | World Precision Instruments | TW100F-4 | Use to make microelectrodes for microinjection |
| Microloader pipette tip | Tool | Eppendorf | CA32950-050 | Autoclave before using to fill up the microelectrodes for microinjection |
| PV820 Pneumatic PicoPump | Tool | World Precision Instruments | SYS-PV820 | Part of microinjection station |
| Microelectrode holder | Tool | World Precision Instruments | MPH6S | Use to hold microelectrode |
| Micromanipulator | Tool | Sutter | MP-85 | Use to position microelectrode in the three-axis |
References
- Farah, C. A., Nagakura, I., Weatherill, D., Fan, X. &. a. m. p. ;. a. m. p., Sossin, W. S. Physiological role for phosphatidic acid in the translocation of the novel protein kinase C Apl II in Aplysia neurons. Mol Cell Biol. 28, 4719-4733 (2008).
- Zhao, Y., Leal, K., Abi-Farah, C., Martin, K. C., Sossin, W. S. &. a. m. p. ;. a. m. p., Klein, . M.Isoform specificity of PKC translocation in living Aplysia sensory neurons and a role for Ca2+-dependent PKC APL I in the induction of intermediate-term facilitation. J Neurosci. 26, 8847-8856 (2006).
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