C57BL/6小鼠已被用于研究Hc的发病机制，并提供了最佳模型。我们正在探索体液免疫对该真菌的潜在保护作用，并制备了多种单克隆抗体[mAb]（针对组蛋白H2B和一种60kDa热休克蛋白），通过腹腔注射后检测其保护效果。
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摘要
摘要
使用该方法学的目的在于：1）提升我们通过抗体或疫苗保护个体、以预防或治疗由荚膜组织胞浆菌（Histoplasma capsulatum）引起的组织胞浆菌病的能力；2）研究毒力因子作为治疗靶点的作用。为制备单克隆抗体（mAb），先对小鼠进行免疫，随后采用本实验室建立的固相ELISA系统评估其免疫反应，并筛选出免疫应答最强的小鼠，分离其脾细胞用于与杂交瘤细胞融合。C57BL/6小鼠已被广泛用于研究H. capsulatum的致病机制，是获取所需数据的最佳模型。为评估单克隆抗体在感染中的作用，小鼠经腹腔注射给予抗H. capsulatum的单克隆抗体或同型匹配的对照单克隆抗体，随后通过静脉（i.v.）、腹腔（i.p.）或鼻内（i.n.）途径感染病原体。在科学文献中，评估单克隆抗体对真菌感染疗效的终点通常依赖于死亡率，并结合早期时间点的菌落形成单位（CFU）测定。生存期（死亡时间）研究至关重要，因其最能反映人类疾病的进程。因此，若无生存曲线，我们干预措施的有效性将无法充分确立。这一点同样适用于疫苗有效性的验证或对毒力突变株的测试。在组织胞浆菌病中，小鼠常在数小时内从活跃状态迅速发展至死亡。某种干预措施（如单克隆抗体给药）可能在初期保护动物免于发病，但疾病可能复发，而短期的CFU实验无法揭示这一情况。除了生存期和真菌负荷检测外，我们还检测感染引发的炎症反应（包括组织病理学、细胞募集和细胞因子反应）。在生存期/死亡时间实验中，小鼠感染后每天至少两次观察其发病迹象。为评估真菌负荷、组织病理学变化及细胞因子反应，小鼠在感染后的不同时间点被实施安乐死。动物实验均依照阿尔伯特·爱因斯坦医学院动物研究研究所的指导原则进行。
方案
1. H. capsulatum 的培养
- 使用10%的漂白剂清洁生物安全柜，随后进行20分钟的紫外照射，为真菌操作做好准备。H. capsulatum 的酵母相需要遵循生物安全二级（BSL II）操作规范，而菌丝相则需要BSL III级防护。后续步骤中使用酵母相。
- 准备一个15 ml的锥形管，加入5 ml PBS。从在37°C培养的BHI血琼脂平板[葡萄糖10 g/L、半胱氨酸0.1 g/L、青霉素-链霉素1%、绵羊红细胞50 ml/L（Colorado Serum Co., Colorado, USA）]上挑取一单菌落H. capsulatum（菌株Hc ATCC G217B），或取-80°C保存的酵母冻存液适量加入PBS中。剧烈涡旋混匀，室温下以1100 × g离心10分钟。小心移除上清液，避免扰动沉淀，加入10 mL新鲜PBS。重复此洗涤步骤三次。将细胞重悬于5 mL PBS中，并转移至50 mL锥形管。
- 为打破细胞聚集，将酵母细胞悬液在生物安全柜内（佩戴面部防护）用10 mL注射器通过26G1/2针头反复推注5次。为分离出小而均一的酵母细胞，将细胞在室温下以55 × g离心1分钟，然后小心吸取并弃去顶部1 ml液体。
- 将细胞悬液加入含有100 ml HAM F12培养基（GIBCO）的无菌锥形瓶中，培养基中添加16 g....
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讨论
本文所述方案表明，抗荚膜组织胞浆菌（H. capsulatum）的单克隆抗体（mAb）可改变实验性小鼠组织胞浆菌病的病程。针对病原体细胞表面抗原的单克隆抗体能够调节宿主与病原体相互作用过程中发生的复杂动态变化。本研究证实，在致死性组织胞浆菌病的小鼠模型中，腹腔注射单克隆抗体可介导保护作用，并提示某些候选蛋白可用于疫苗开发，例如H2B、M抗原（表面过氧化氢酶）(3) 和Hsp60。在体内实验中，给予针对Hc Hsp60和H2B的保护性单克隆抗体可降低感染小鼠器官中的真菌负荷和炎症反应，并延长其存活时间。
尽管针对荚膜组织胞浆菌（H. capsulatum）的疫苗研发是一个令人振奋的研究领域，但疫苗在免疫功能低下个体中可能无效，因为他们未必能够有效启动免疫应答。因此，显然这类人群可能最受益于针对荚膜组织胞浆菌抗原（H. capsulatum antigens）的单克隆抗体（mAb）被动治疗。我们的数据表明，针对Hsp60的单克隆抗体，尤其是与其他靶向细胞表面抗原的单克隆抗体联用时，可能改善组织胞浆菌病患者的治疗效.......
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披露
未声明任何利益冲突。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 生物安全柜（BSL2） | |||
| 15 mL 圆锥形离心管 | Falcon BD | ||
| HAM F-12 培养基 | GIBCO，由 Life Technologies 提供 | ||
| 37°C 摇床 | |||
| 涡旋振荡器 | |||
| 50 mL 圆锥形离心管 | Falcon BD | ||
| 26G1/2 针头 | BD Biosciences | ||
| 10 mL 注射器 | BD Biosciences | ||
| 250 mL 三角烧瓶 | |||
| FPLC（快速蛋白液相色谱）系统 | GE Healthcare | ||
| 酶标仪 | BioTek | ||
| 麻醉剂（氯胺酮和赛拉嗪） | |||
| 层析柱支架 | |||
| 尼龙绳 | |||
| 加热灯 | |||
| 70μm 细胞滤网 | Falcon BD | ||
| BHI 琼脂平板 | GIBCO，由 Life Technologies 提供 |
参考文献
- Casadevall, A., Mukherjee, J., Scharff, M. D. Monoclonal antibody based ELISAs for cryptococcal polysaccharide. J. Immunol. Methods. 154, 27-35 (1992).
- Guimaraes, A. J., Frases, S., Gomez, F. J., Zancope-Oliveira, R. M., Nosanchuk, J. D. Monoclon....
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