Dissekering av en mus Eye för en hel berget av pigmentepitelet
Summary
En formell demonstration av dissekering av en mus öga, vilket resulterar i en hel montera av pigmentepitelet.
Abstract
Den pigmentepitelet (RPE) ligger på baksidan av däggdjur ögat, precis under neurala näthinnan, som innehåller fotoreceptorer (stavar och tappar). RPE är ett monolager av pigmenterade cuboidal celler och medarbetare i nära samarbete med neurala näthinnan precis ovanför det. Denna förening gör RPE av stort intresse för forskare som studerar retinala sjukdomar. RPE är också platsen för en in vivo-test av homologi riktad DNA-reparation, p un-analysen. Musen ögat är särskilt svår att dissekera på grund av sin ringa storlek (ca 3,5 mm i diameter) och dess sfäriska form. Denna artikel visar i detalj ett förfarande för dissektion av ögat vilket resulterar i ett helt berg RPE. Vid detta förfarande visar vi hur du arbetar med, snarare än mot, den sfäriska struktur i ögat. Kortfattat, är bindväv, muskler och synnerven bort från baksidan av ögat. Då är hornhinnan och linsen tas bort. Därefter är strategiska nedskärningar som leder till betydande utplaning av de återstående vävnad. Slutligen är neurala näthinnan försiktigt lyftas av, avslöjar en intakt RPE, som fortfarande är knuten till den underliggande åderhinnan och sklera. Hela fäste kan användas för att utföra p un-analysen eller för immunohistokemi eller immunofluorescens bedömning av RPE vävnad.
Protocol
Discussion
RPE är platsen för p FN-analysen, en in vivo-test av homologi riktad reparation. P un-analysen har använts för att studera effekterna av olika DNA-skador 1,2 och DNA-skador signalsystem och gener reparation 3,4,5 på frekvensen av homologi riktad reparation. Denna analys är mycket känslig, upptäcka encelliga händelser på RPE 1. Det kan också upptäcka skillnader i tidpunkten för homologi riktad reparation händelser under utveck…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institute of Environmental Health Sciences [K22ES012264 till AJRB] och en American Cancer Society InstitutionalResearch Grant [ACS-IRG-00-173-04] pilotprojekt projectaward [till AJRB]. Vi tackar också medlemmarna i biskop lab för kritisk läsning av manuskriptet och kommentarer på videon och Adam Brown i synnerhet för exempel på vad man inte ska göra. Vi tackar dr Donald McEwen av Greehey Barnens Cancer Research Institute för att låta oss använda hans dissekera omfattning / video kamera inställd på filmning av dissekering videon. Vi tackar Daron Brown vid Corte Instrument för slipning och reparation av våra microdissection verktyg.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| straight forceps | Roboz | RS-4903 | tip: .08 x .04 mm material: INOX | |
| 45° forceps | Roboz | RS-5005 | tip: .05 x.01 mm material: INOX | |
| 15° “up” forceps | Roboz | RS-5045A | tip: .1 x.06 mm material: INOX | |
| spring scissors | Roboz | RS-5604 | comb. tip width 0.3mm cutting edge length 3mm material: stainless steel | |
| binocular dissecting microscope | Ziess | Discovery V.8 | use reflected light source | |
| phalloidin | Invitrogen | A22283 | Alexa Fluor 546 |
References
- Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice. Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).
- Reliene, R. H. l. a. v. a. c. o. v. e., Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice. Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).
- Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice. Cancer Res. 60, 395-399 (2000).
- Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion. J. Nucleic Acids. , (2010).
- Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo. Nucleic Acids Res. , (2010).
- Bishop, A. J. p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development. Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).
- Bodenstein, L., Sidman, R. L. Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity. Dev Biol. 121, 192-204 (1987).
- Burke, J. M. Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?. Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).
