Summary
FRAP已被用来量化绿色荧光蛋白(GFP)标记在培养细胞中的蛋白质的流动性。我们研究分析了GFP的荧光漂白后恢复的百分比移动/静止的分数。在这项研究中,FRAP刺海马神经元。
Abstract
FRAP已被用来量化GFP标记的蛋白质的流动性。使用一个强大的激励激光,一个GFP标记蛋白的荧光漂白,在感兴趣的区域。 GFP标记的来自该地区以外的的漂白蛋白扩散到感兴趣的区域时,该区域的荧光恢复。蛋白质的流动性进行了分析,通过测量荧光恢复率。这种技术可以用来描述蛋白质的流动性和周转率。
在这项研究中,我们对培养海马神经元(增强型绿色荧光蛋白)EGFP的载体。我们使用蔡司710共聚焦显微镜,光漂白的在一个单一的脊椎的绿色荧光蛋白的荧光信号,然后取时间的推移图像记录荧光漂白后恢复。最后,我们估计在刺的绿色荧光蛋白的移动和静止的分数的百分比,通过分析成像数据,使用ImageJ和Graphpad软件。
这FRAP协议显示了如何执行基本FRAP实验,以及如何对数据进行分析。
Protocol
1。神经元转
- 文化胚胎第18天(E18)大鼠海马神经元- D -聚赖氨酸包MatTek 35毫米的玻璃底菜 1 。 (DIV),在16-18天的体外转染的神经元,使用Clontech公司CalPhos哺乳动物转染试剂盒。首先,用1.5毫升培养基代替贝科改良Eagle培养基 (DMEM),每35毫米盘0.5小时之前转。 (步骤1.6)使用,保存在一个无菌的15毫升管的原培养液。
- 混合使用无菌H 2 O(Clontech公司)和12.4μL2米钙的解决方案(Clontech公司)的总体积100μL的10μg的pEGFP - N1质粒DNA。
- 从步骤1.2)中添加的混合物100μL2 ×哈佛商学院滴加而涡旋2 ×哈佛商学院在中等速度。
- 让坐在混合物在室温下放置20分钟,然后添加步骤1.3)DMEM培养液培养的神经元最终混合物。
- 为1-1.5小时,放入37℃培养箱中培养的神经元。
- 删除磷酸钙介质中,然后用DMEM三次洗细胞。在返回培养皿中的孵化器,交流与原培养液DMEM培养基。
2。在脊柱的FRAP实验
- 用于转染后二至四天的FRAP实验的神经元。
- 从35毫米的玻璃底菜更换培养液,立即加入预热Tyrode液,其中包含(毫米),HEPES 10 5 145氯化钠,氯化钾,葡萄糖10,甘氨酸0.005,2.6氯化钙和氯化镁2 1.3(用NaOH调整pH至7.4)。
- 蔡司LSM 710共聚焦显微镜是用于FRAP实验。蔡司TempModule系统是用来控制温度(37℃),湿度和工作系统的CO 2(5%)。确保连接和一瓶水,这是用来平衡湿度,是装满了水,CO 2坦克。
- 查找100 ×目标(αplan的复消色差透镜100 × / 1.46油)的转染成熟树突。如果在盘转染细胞稀疏,寻找所需的细胞与40 ×的目标(计划NEOFLUAR 40 × / 1.3油),然后切换到100 ×目标捕捉图像。
- 使用5 ×光学变焦和256 × 256像素分辨率的图像一小段几个刺的枝蔓。要拍摄图像,使用额定转速(像素停留时间为3.15微秒)需要0.5秒完成扫描。针孔设置为2μm的获得较强的荧光。到图像时,尝试使用激光传输低,例如1-5%,以避免漂白的整个形象。
- 选择感兴趣的脊椎。在我们的实验中,我们选择与他们的脊柱头部直径约1微米的蘑菇刺。
- 为了做一个FRAP实验,漂白前5个控制影像,然后漂白脊柱利益标称100%激光传输的10倍[氩激光功率为30兆瓦,488激光线的50%(15毫瓦),和约3-4毫瓦,达到通过显微镜488激光线],然后漂白后,立即捕捉了一系列的图像。在这个实验中,图像被捕获漂白后每15秒1秒。调整的时间间隔应根据不同的目标蛋白质和不同的实验设计( 图1) 。
- 保存图像。
3。数据分析
- 与ImageJ软件中打开图像。
- 对齐使用对齐工具图像的堆栈 - ImageJ(“插件”→“栈洗牌”→“对齐堆栈片”→“翻译”和/或“刚体”),使脊柱的利益不浮换句话说 - 它仍然在同一位置上的图像。
- 测量相对利益(F S)的脊椎,一个转,但漂白地区(对照组),在时间的推移图像和背景区域(F B)的荧光强度,使用ImageJ工具“力度V时间显示器”( “插件“→”栈 - 洗牌“→”强度V时间显示器“)。控制区域可以是一个倍受关注的远端树突的一块。背景区是一个非荧光的地区。
- 计算前(F C0)和(F C)漂白后,通过比较控制区的荧光光漂白率(R )。
R = F C / F C0。 - 目标脊柱的荧光强度(F)的规范如下:
F =(F S - F B)/ R。 - 曲线拟合Graphpad Prism软件一阶段的指数方程( 图2)或官方所用的荧光强度的目标脊柱ř类似软件。
- 计算移动的分数(F M)和不动的一小部分(一 )由下列公式:
F M = F∞/ F 0,
其中,F∞全面复苏后的荧光强度,F 0是前漂白的荧光强度。
F的第I = 1 - F 米。
4。代表性的成果:
在这项研究中,我们执行一个成熟的海马神经元的FRAP实验。在18-22格,已形成了蘑菇刺。用我们的方法,在一个小区域的荧光强度的动态变化,如脊椎,可以被记录下来。
要分析的EGFP荧光恢复过程中,我们采取控制之前,漂白和5张1图像的每1在15秒漂白后立即第二。图像分辨率是足够的定量分析。标记的荧光蛋白的荧光恢复型材高度重复性。
我们还简要说明如何定义一个荧光蛋白的移动和静止的分数,使用ImageJ和Graphpad Prism软件。我们在这里展示的FRAP方法和分析,可以广泛应用于神经科学,细胞生物学等研究。
图1。FRAP EGFP荧光测量在脊柱从培养的海马神经元。红色箭头指示的漂白时间。照片代表前同一地区(预),0,1,5,10,15秒后漂白。字母S,C和B,分别标有脊柱,控制和背景区域。在实验过程中,神经元保持在37 ° C。比例尺,1微米。
图2。FRAP EGFP荧光曲线超过15秒的时间。绿线显示了原始的曲线;红线显示正常化的曲线。曲线上的点显示FRAP每隔1秒。一个阶段的指数方程拟合曲线。漂白前的平均荧光计为100%。在这个实验中,移动的比例(MF)是94%,在不动的分数(IF)为6%。
Discussion
FRAP分析已被广泛使用在体内和体外1-2研究。这种技术通常利用GFP 融合蛋白 ,虽然它也可以用红藻融合蛋白3。这种分析是敏感的,可以用来描述GFP标记的蛋白质的流动性。
要产生有意义的FRAP分析,重要的是要避免不必要的漂白FRAP实验之前和期间。有两种方法来实现这一。首先,搜索和观察实验的神经元的过程要快。特别是,神经元与100X的目标很长一段时间的观察明显漂白的荧光。二,高的激光功率和频繁扫描,往往会增加漂白的可能性。因此,将需要计算在控制区域的漂白率,然后在实验地区的FRAP曲线正常化。正火的方法已被描述的协议(见步骤,细节为3.3-3.5)。
漂白步骤,也是确保获得良好FRAP结果的关键。在这个实验中,我们漂白利息的10倍,100%的激光传输的脊椎。这条件是足够的一个背景在一个固定的编制水平的脊柱荧光漂白的。因此,我们设置漂白后的荧光强度在0秒作为背景相同数量。根据在第一次扫描的速度,可能已经被检测到的荧光恢复大量感兴趣的蛋白质是流动性很强。
已经开发了许多荧光蛋白探针研究蛋白质动力学与FRAP。互补性办法,例如,使用photoactivatable GFP(PA - GFP的),或photoconvertible变种。连同FRAP还原技术,这些工具成为不可或缺的活细胞成像研究4-6。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作得到了国家耳聋与其他交流障碍研究所(NIDCD)校内计划。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
35 mm glass-bottom dishes | MatTek Corp. | P35GC-1.0-14-C | |
CalPhos Mammalian Transfection Kit | Clontech Laboratories | 631312 | |
pEGFP-N1 plasmid | Clontech Laboratories | 6085-1 | |
Zeiss confocal microscope | Carl Zeiss, Inc. | LSM 710 | |
Zeiss TempModule system | Carl Zeiss, Inc. | N.A. | |
ImageJ software | National Institutes of Health | N.A. | |
Graphpad Prism software | GraphPad Software Inc. | N.A. |
References
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