Många genetiska manipulationer och / eller intramyocardial injektioner av gener, proteiner, celler och / eller biomaterial som överlagras på den dimension av tid i studier av akut ischemi / reperfusionsskada och kronisk ombyggnad i möss. Denna video illustrerar mikrokirurgisk förfaranden för ischemi / reperfusion, permanent kranskärlssjukdom ligation och intramyocardial studier injektion.
Mouse models are a valuable tool for studying acute injury and chronic remodeling of the myocardium in vivo. With the advent of genetic modifications to the whole organism or the myocardium and an array of biological and/or synthetic materials, there is great potential for any combination of these to assuage the extent of acute ischemic injury and impede the onset of heart failure pursuant to myocardial remodeling.
Here we present the methods and materials used to reliably perform this microsurgery and the modifications involved for temporary (with reperfusion) or permanent coronary artery occlusion studies as well as intramyocardial injections. The effects on the heart that can be seen during the procedure and at the termination of the experiment in addition to histological evaluation will verify efficacy.
Briefly, surgical preparation involves anesthetizing the mice, removing the fur on the chest, and then disinfecting the surgical area. Intratracheal intubation is achieved by transesophageal illumination using a fiber optic light. The tubing is then connected to a ventilator. An incision made on the chest exposes the pectoral muscles which will be cut to view the ribs. For ischemia/reperfusion studies, a 1 cm piece of PE tubing placed over the heart is used to tie the ligature to so that occlusion/reperfusion can be customized. For intramyocardial injections, a Hamilton syringe with sterile 30gauge beveled needle is used. When the myocardial manipulations are complete, the rib cage, the pectoral muscles, and the skin are closed sequentially. Line block analgesia is effected by 0.25% marcaine in sterile saline which is applied to muscle layer prior to closure of the skin. The mice are given a subcutaneous injection of saline and placed in a warming chamber until they are sternally recumbent. They are then returned to the vivarium and housed under standard conditions until the time of tissue collection. At the time of sacrifice, the mice are anesthetized, the heart is arrested in diastole with KCl or BDM, rinsed with saline, and immersed in fixative. Subsequently, routine procedures for processing, embedding, sectioning, and histological staining are performed.
Nonsurgical intubation of a mouse and the microsurgical manipulations described make this a technically challenging model to learn and achieve reproducibility. These procedures, combined with the difficulty in performing consistent manipulations of the ligature for timed occlusion(s) and reperfusion or intramyocardial injections, can also affect the survival rate so optimization and consistency are critical.
Kranskärlssjukdom fortsätter att vara ett epidemiologiskt och skattemässigt betydande folkhälsoproblem. Betydande grundforskning behövs fortfarande för att förstå de mekanismer genom vilka skador och ombyggnader gå vidare och hur potentiella läkemedel kan modulera dessa processer om de skall utvecklas för kliniskt bruk. Gnagare är vanligast och det breda utbudet av genetiskt modifierade möss som finns gör denna art till en mer attraktiv modell.
Även om det finns skillnader mellan möss och andra arter, det finns många fördelar med att en mus modell. Användning av en enkel dissekera omfattning eller förstoringsglas och väl upplysta förhållanden gör det möjligt för kärlsystem till lätt ses (för detaljerad anatomi i kärlsystemet, se Salto-Tellez et al. 2004 13). För att minska risken för postoperativ dödlighet, är det mycket viktigt att undvika att skära stora fartyg eftersom den totala blodvolymen hos en 25g mus är mindre än 2 ml 14. I händelse av att kraftig blödning uppstår kan lätt tillämpning av tryck eller precisera BRÄNNING användas för att stoppa blödningen.
Detta förfarande kan också ändras på olika sätt. Till exempel kan mössen vara sövda med isofluran, ketamin / xylazin, eller natrium pentobarbital och urval bestäms av varaktigheten av protokollet 15-18. Tå-nypa reflex är den mest använda index på djupet av anestesi. Vidare, för att förbättra sannolikheten för långsiktig överlevnad, vissa forskare använder antiarytmika såsom lidokain för att minska förekomsten av dödliga arytmier 19,20 Det måste dock beaktas att detta nyligen har visat sig ha antiapoptotic egenskaper i en akut modell 21. Dessutom, för att minska postoperativ smärta kan analgetika såsom buprenorfin ges under de första 48 timmarna efter operationen 3,16,17,22,23. För att upprätthålla kroppstemperaturen under operation (särskilt för längre protokoll), är en rektalsond i serie med en värmedyna som ofta används i stället för isotermisk pad. För ischemi / reperfusion och / eller ischemisk före eller postconditioning: hur länge ocklusion (er) och reperfusion (s) kan ändras, för permanent ocklusion, kan storleken på infarkten ändras genom att justera placeringen av ligatur; och för intramyocardial injektioner (t.ex. celler, proteiner) kan det vara 1-3 injektion platser och volymen per injektion kan vara upp till 15 l 24. Om celler som injiceras, mätaren för nålen som används (vanligen 26-30) 5,25,26 bör väljas utifrån storleken på cellerna så att innerdiameter nålen är tillräckligt stor för att undvika sheering. För att undvika förväxlar på grund av inflammatoriska processer som utlöses av operationen, har vissa forskare rapporteras med en snara som är manipulerad ex vivo för att täppa och reperfuse hjärtan i en sluten kista mus som helst efter operationen 27-29. På senare tid Gao et al. 30 har visat att tillfälliga och permanenta ocklusion kan utföras utan behov av ventilation och ett fåtal laboratorier har börjat använda ultraljud för att utföra stängd kista intramyocardial injektioner 25,31.
Sedan den första studie som visar möjligheten att underbindning av kranskärl i möss publicerades av Johns och Olson 1954 32, har många andra antagit denna modell och modifierade den för att studera olika aspekter av myokardskada och ombyggnad 3,33-45. Den typ av möss i fråga om storlek, reproduktiv förmåga och jämförelsevis mindre kostnader för inköp och underhåll gör denna art ett tilltalande verktyg för ett brett utbud av fysiologiska och patofysiologiska studier. Som miniatyrisering av teknik för avbildning in vivo framsteg 46-49, samt resurser för att utföra och analysera storskaliga genomik och proteomik, drug screening, effekt av cell-baserade och / eller protein behandlingar samt biomaterial 50-64, kombinerat med allt bredare spektrum av genetiska manipulationer som erbjuds genom allmänt förekommande eller vävnad specifika transgena eller mutant / knockoutmöss kommer murina modell av hjärtinfarkt fortsätter utan tvekan att vara ett ovärderligt verktyg för att utvärdera akut hjärt-skada och lång sikt ombyggnad. Därför finns det obestridliga värde i att kunna utföra dessa experiment tillförlitligt och reproducerbart.
The authors have nothing to disclose.
Jag vill tacka för avdelningen för forskning och forskarutbildning för att ge medel till stöd för min forskning och avdelningen för komparativ medicin för sin vaksamhet och hjälp. Jag skulle också vilja att erkänna institutionen för fysiologi för deras stöd och vägledning samt studenter och tekniker i mitt labb för deras hjälp. Avslutningsvis vill jag tacka mina postdoktorala mentor, Dr Charles E. Murry, för utbildning möjlighet att under denna tid jag lärde musen mikrokirurgi.
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Long Vanna Scissors | George Tiemann | 160-159 | ||
Micro Dissecting Scissors | George Tiemann | 160-161 | ||
Forceps – straight, 1×2 teeth | George Tiemann | 105-205 | ||
Scalpel handle #3 | George Tiemann | 105-64 | #10 sterile blade | |
Forceps – half curved serrated | George Tiemann | 160-19 | ||
Tissue Scissors | George Tiemann | 105-410 | ||
Castroviejo Needle Holder | Miltex | 18-1828 | ||
Cook Eye Speculum | Miltex | 18-63 | ||
Surgipro II 8-0 | Suture Express | VP-900-X | ||
Prolene 6-0 | Suture Express | 8776 | ||
Germinator 500 Bead Sterilizer | Cellpoint Scientific | 65369-1 | ||
Deltaphase isothermal pad | Braintree Scientific | 39DP | ||
Hamilton syringe – 25μl | Hamilton | 80430 | ||
30 gauge beveled needle | Hamilton | 7803-07 | ||
Ventilator | Kent Scientific | TOPO |