संशोधित Annexin सेल मौत के सटीक आकलन के लिए आयोडाइड वी / Propidium Apoptosis परख
Summary
कोशिका मृत्यु के मूल्यांकन के लिए एक सही तरीका वर्णित है. प्रोटोकॉल पारंपरिक Annexin / वी propidium आयोडाइड (पीआई) प्रोटोकॉल, जो 40% सेल लाइनों और पशु मॉडल की एक व्यापक रेंज से प्राथमिक कोशिकाओं में झूठी सकारात्मक घटनाओं के लिए प्रदर्शन सुधार पर है.
Abstract
सेलुलर apoptosis के अध्ययन में काफी प्रवाह cytometry आधारित विधियों की शुरूआत के बाद से प्रभावित किया गया है. Propidium आयोडाइड (पीआई) Annexin वी के साथ संयोजन के रूप में व्यापक रूप से प्रयोग किया जाता है निर्धारित करने के लिए अगर कोशिकाओं प्लाज्मा झिल्ली अखंडता और पारगम्यता 1,2 में मतभेद के माध्यम से व्यवहार्य, apoptotic, या परिगलित हैं. Annexin वी / पीआई प्रोटोकॉल apoptotic कोशिकाओं 3 अध्ययन के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया दृष्टिकोण है . PI अन्य परमाणु दाग की तुलना में अधिक अक्सर इस्तेमाल किया जाता है क्योंकि यह किफायती, स्थिर और सेल व्यवहार्यता का एक अच्छा संकेत है और इसकी क्षमता कोशिकाओं 4,5 में रहने वाले डाई बाहर के आधार पर,. पीआई की क्षमता के लिए एक सेल में प्रवेश झिल्ली की पारगम्यता पर निर्भर है, पीआई रहते हैं या जल्दी apoptotic एक अक्षुण्ण प्लाज्मा झिल्ली 1,2,6 की उपस्थिति के कारण कोशिकाओं दाग नहीं करता है. देर apoptotic और परिगलित कोशिकाओं में, प्लाज्मा और परमाणु झिल्ली की अखंडता 7,8 कम हो जाती है, PI झिल्ली के माध्यम से पारित करने के लिए, न्यूक्लिक एसिड में intercalate, और लाल प्रतिदीप्ति 1,2,9 प्रदर्शन की अनुमति है. दुर्भाग्य से, हम पाते हैं कि पारंपरिक Annexin वी / पीआई प्रोटोकॉल झूठी सकारात्मक घटनाओं की एक महत्वपूर्ण संख्या (40%) है, जो PI धुंधला cytoplasmic 10 डिब्बे के भीतर शाही सेना के साथ जुड़े रहे हैं के लिए सीसा. (Cytoplasmic अनुपात: 0.5 <परमाणु) सबसे अधिक 10 घटना दिखाने के पशु मॉडल की एक विस्तृत रेंज में प्राथमिक कोशिकाओं और सेल लाइनों, बड़े कोशिकाओं के साथ प्रभावित कर रहे हैं. इस के साथ साथ, हम एक संशोधित Annexin वी / पीआई विधि है कि कोशिका मृत्यु के पारंपरिक तरीकों की तुलना में मूल्यांकन के लिए एक महत्वपूर्ण सुधार प्रदान करता है प्रदर्शित करता है. इस प्रोटोकॉल के एक धुंधला निम्नलिखित कोशिकाओं में RNase के प्रवेश को बढ़ावा देने के लिए सेल फिक्सिंग के दौरान सेलुलर पारगम्यता में परिवर्तन का लाभ लेता है. दोनों समय और RNase की एकाग्रता किया गया है एक cytoplasmic शाही सेना को हटाने के लिए अनुकूलित. परिणाम पारंपरिक Annexin / वी PI प्रोटोकॉल (cytoplasmic PI धुंधला के साथ <5% की घटनाओं) पर एक महत्वपूर्ण सुधार है.
Protocol
Discussion
Annexin वी / पीआई प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत पारंपरिक प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण है और cytoplasm जो भी पीआई के लिए उच्च संबंध है में शाही सेना की उपस्थिति के खाते में लेता है. RNase 1% formaldehyde निर्धारण धुंधला हो जाना प्रक्रिया में देर से कदम के बाद एक (50 μg / एमएल) का परिचय काफी परमाणु PI धुंधला की सटीकता में सुधार. कोई नकारात्मक प्रभाव परमाणु PI धुंधला हो जाना या प्लाज्मा झिल्ली Annexin वी धुंधला में मनाया जाता है. RNase एक इलाज के बिना, PI दाग परिणाम के 40% अप करने के लिए झूठी सकारात्मक घटनाओं, जो बहाव 10 निष्कर्ष पर एक संभावित महत्वपूर्ण और नकारात्मक प्रभाव की ओर जाता है करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
हमारे संशोधित Annexin धुंधला वी / पीआई प्रोटोकॉल सरल है और प्रभावी ढंग से सेल प्रकार (प्राथमिक कोशिकाओं के एक विस्तृत रेंज में इस्तेमाल किया गया: murine अस्थि मज्जा मैक्रोफेज और splenocytes, स्वाइन फेफड़ों निवासी कोशिकाओं, फेफड़ों वायुकोशीय मैक्रोफेज, mesenteric लिम्फ नोड आइसोलेट्स, परिधीय रक्त leukocytes splenocytes, चिकन blastoderm कोशिकाओं, सुनहरीमछली प्राथमिक गुर्दे मैक्रोफेज, कार्प परिधीय रक्त leukocytes, सेल लाइनों: रॉ 264.7 मैक्रोफेज, Jurkat टी कोशिकाओं, सूअर 3D4/31 मैक्रोफेज, सीसीएल-71 ज़र्द मछली फिन fibroblasts, 3B11 कैटफ़िश बी 10 कोशिकाओं). यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि कोशिकाओं विभिन्न प्राथमिक कोशिकाओं आम तौर पर झूठी सकारात्मक 10 घटनाओं की एक बड़ी संख्या होने के साथ झूठी सकारात्मक PI धुंधला हो जाना, से प्रभावित कर रहे हैं है. इन सेलुलर आबादी के बीच मतभेदों को झूठी सकारात्मक PI धुंधला सेल आकार में अंतर करने के लिए आंशिक रूप से जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, लेकिन शाही सेना सामग्री में मतभेद से भी परिणाम हो सकता है. के रूप में इस प्रक्रिया के इस तरह के समावेश, प्रायोगिक प्रणाली है कि का उपयोग दूसरों के बीच, genotoxic तनाव के दौर से गुजर कोशिकाओं, सेल चक्र गिरफ्तारी thymidine या hydroxyurea जैसे दवाओं, virally संक्रमित कोशिकाओं, और जहां भ्रूण विकास प्रगति कोशिकाओं पर अध्ययन के साथ इलाज किया कोशिकाओं के लिए विशेष रूप से प्रासंगिक है सेलुलर शाही सेना संश्लेषण में असतत परिवर्तन द्वारा विशेषता है.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन में एक प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग परिषद कनाडा () NSERC अनुसंधान अनुदान और एक अलबर्टा कृषि अनुदान कंसोर्टियम DRB अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था. AMR एक NSERC Vanier कैनेडियन स्नातक छात्रवृत्ति, अलबर्टा शिक्षण assistantship और महारानी एलिजाबेथ द्वितीय स्नातक छात्रवृत्ति के एक विश्वविद्यालय के माध्यम से समर्थित है.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| 1 x PBS-/- | ||||
| 1 x Annexin V Binding Buffer | BD Biosciences | 556454 | ||
| Annexin V-Alexa Fluor 488 | Molecular Probes (Invitrogen) | A13201 | ||
| Propidium iodide (PI) | Sigma-Aldrich | P4864 | 1 mg/mL in H2O | |
| 2% Formaldehyde | Sigma-Aldrich | F1268 | ||
| RNase A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R4642 | ||
| DRAQ5 | Biostatus | DR50050 | Dilute 1:60 in 1 x PBS-/- |
References
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