研究肠道趋向性T细胞迁移的竞争性归巢实验

摘要

竞争性归巢实验可直接在单个小鼠体内评估两种不同细胞群体的迁移特性。本文通过比较体外生成的肠道趋向性T细胞与非肠道趋向性T细胞的迁移能力，说明该实验方法。

摘要

为了发挥其功能，淋巴细胞需要离开血液并迁移至体内的不同组织。淋巴细胞与内皮细胞的黏附及其组织外渗是一个多步骤过程，由淋巴细胞表面表达的不同黏附分子（归巢受体）及其在内皮细胞上表达的相应配体（地址素）共同调控^{1 2}。尽管这些黏附受体的功能可在一定程度上通过离体（ex vivo）实验进行研究，但评估其在体内（in vivo）淋巴细胞黏附与迁移过程中生理相关性的最终标准，是观察它们在活体环境中的作用。为此，已有两种互补的实验策略被广泛应用：活体显微技术（IVM）和归巢实验。尽管活体显微技术对于实时、在不同组织中精确解析特定黏附受体在黏附级联反应中的作用至关重要，但该方法耗时且劳动强度大，通常需要建立复杂的外科手术技术，还需预先分离出均一的细胞群体，并且每次实验仅能分析一个组织或器官。相比之下，竞争性归巢实验能够在同一只小鼠体内直接且同时比较两种（甚至更多）细胞亚群的迁移能力，并允许在单次实验中对多种组织及大量细胞进行分析。

本文描述了一种经典的竞争性归巢实验方案，用于评估特定细胞类型相对于对照细胞群体归巢至特定组织的能力优势或劣势。我们选择展示肠道趋向性T细胞与非肠道趋向性T细胞的迁移特性，因为肠黏膜是人体与外界环境接触面积最大的表面，也是迁移机制研究最为清晰的淋巴外组织。此外，近期研究已证实，维生素A代谢产物全反式维甲酸在调控T细胞肠道趋向性中发挥关键作用。转 视黄酸（RA）是诱导淋巴细胞表达肠道特异性黏附受体（整合素 α4β7 和趋化因子受体 CCR9）的主要分子机制。因此，我们能够高效地生成大量具有肠道趋向性和非肠道趋向性的淋巴ocytes 离体通过在有或无视黄酸（RA）的条件下激活T细胞，最终可用于本文所述的竞争性归巢实验。

方案

1. 离体 肠道归巢T细胞与对照T细胞的制备（见图1）

1. 通过研磨一只野生型小鼠的脾脏来分离脾细胞。将细胞悬液重悬于 PBS 中，以 400 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，通过将细胞沉淀重悬于 4 mL ACK 裂解缓冲液中 2–3 分钟以裂解红细胞。随后加入 5 mL PBS，以 400 × g 离心 5 分钟，弃去上清液。
2. 将总脾细胞以 1 × 10⁶/mL 的浓度重悬于 IMDM + 10% FBS + 50 mM 2-巯基乙醇 + 青霉素/链霉素（完全 IMDM）中。将细胞分为两组，其中一组添加全反式维甲酸（RA）或合成的维甲酸受体激动剂（如 Am80 或 Am580），终浓度为 100–200 nM ³。在 RA 或 RAR 激动剂存在下激活的 T 细胞将上调 α4β7 和 CCR9 表达，从而转化为肠道趋向性 T 细胞；而在无 RA 条件下激活的 T 细胞则作为对照 T 细胞。
3. 将 1.5–2.0 mL 细胞悬液加入已预先包被抗 CD3（10 mg/mL）和抗 CD28（10 mg/mL）的 24 孔板各孔中，在 37°C、5% CO₂ 条件下孵育（包被方法：每孔加入 500 μL 含抗 CD3 和抗 CD28 的 PBS 溶液，37°C 孵育 2 小时，随后用 2 mL PBS 洗涤两次）。
4. 为避免 T 细胞过度刺激，在培养 2–3 天后，将细胞....

讨论

尽管归巢实验能够提供关于特定组织中总体细胞群体迁移的非常有价值的信息，但应当注意的是，这些实验并未直接分析内皮细胞黏附，因此无法区分特定归巢受体在多步骤黏附级联反应（如初始黏附/滚动、活化或牢固黏附）中的具体作用环节。确定归巢受体在黏附级联中特定功能的金标准是活体显微镜技术（IVM），该技术可实时直接观察单个荧光标记的T细胞（或其他细胞，甚至荧光标记的微珠）与内皮细胞的相互作用。然而，IVM耗时较长，需要对小鼠进行麻醉，涉及繁琐的外科手术操作，并且在标记和注射前需预先分离大量纯度高且均一的细胞群体。此外，某些组织（如中枢神经系统（CNS）和胸腺）难以通过IVM进行观察。最后，IVM实验需要固定组织，而肝脏、肺和肠道等部分器官/组织难以实现有效固定（关于IVM的详细讨论参见参考文献⁶）。

另一方面，归巢实验相对容易建立，可以通过共注射两种不同标记的T细胞群体进行竞争性实验，并且能够通过流式细胞术（FACS）在单次实验中同时检测多个组织/器官和细胞群体。在竞争性归巢实验中，目的是确定一种T细胞群体相对于另一种（不同标记的）T细胞群体在不同组织中的相对迁移能力。由.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>动物：C57BL/6小鼠常用于T细胞分离。此外，CD45.1和Thy1.1同源品系可从杰克逊实验室（Bar Harbor, ME）获得。
<强>培养基: <强>IMDM （伊斯基沃’s 改良杜尔贝科培养基’s 培养基 + L-谷氨酰胺 + Hepes）加 10% <强>热灭活胎牛血清 （胎牛血清，低内毒素，Gibco）®，Invitrogen，Carlsbad，CA）中，并添加100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素（HyClone Antibiotics，Waltham，MA）、0.5 mg/ml两性霉素B/抑菌素（Gibco）和50 mM β-巯基乙醇–乙醇。
<强>ACK红细胞裂解缓冲液（红细胞，10 mM KHCO₃）3，150 mM NH4Cl，0.1 mM EDTA，pH 8.0），调节pH至7.2–7.4，并于室温保存。
<强>PBS （磷酸盐缓冲液，Hyclone，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）
<强>流式细胞术（FACS）培养基(PBS 或 IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA)。使用 Selectin-Fc 融合蛋白进行染色时，应采用含 2 mM Ca 的培养基++ 所有步骤（包括流式细胞术数据采集）均应使用IMDM培养基。
<强>T细胞标记与过继转移：CFSE（羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯）， <强>CMTMR Molecular Probes 公司的 ((5-(和-6)-(((4-氯甲基)苯甲酰基)氨基)四甲基罗丹明)®，Invitrogen，Carlsbad，CA）。1000倍储存液应使用DMSO配制（5 mM） <强>CFSE，20 mM <强>CMTMR) 并于 -20 保存°C.
<强>多克隆T细胞激活24孔板或96孔板 <强>(经组织培养处理的聚苯乙烯平底带盖培养板（BD Falcon，Franklin Lakes, NJ）在37℃孵育2小时°分别用含有抗CD3和抗CD28抗体（各10 mg/mL）的50 mL PBS包被培养板。随后，用PBS洗涤培养板两次，并立即用于T细胞培养。或者，可使用包被有抗CD3/抗CD28抗体的Dynabeads（Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA）替代包被在板上的抗体来激活T细胞。
<强>流式细胞术（FACS）染色： 多克隆激活： <强>CD3 (1452C11) <强>CD28 (37.51)。谱系单克隆抗体： <强>CD4 (L3T4) <强>CD8a (Ly-2) <强>Thy1.2 （CD90.2/53-1.2）， <强>CD45.2 (104). 肠道归巢受体：纯化 <强>CCR9 （CD199/eBioCW-1.2，eBioscience，美国加利福尼亚州圣地亚哥） <强>a4b7（LPAM-1/DATK3）， <强>同型对照 （IgG2a，k）。皮肤归巢受体： <强>P-选择素-Fc （纯化小鼠P-选择素-IgG融合蛋白，BD Pharmingen，美国加利福尼亚州圣何塞） <强>E-选择素-Fc （重组小鼠E-选择素/Fc融合蛋白，R&D Systems，明尼阿波利斯，明尼苏达州）及相应的二抗试剂 <强>山羊F(ab’)2 抗人 IgG R-PE （Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）
<强>全部-转录 视黄酸（Sigma，美国密苏里州圣路易斯）在制备过程中使用黄色灯泡或间接光源照射下，用无水乙醇或DMSO重悬。将分装样品储存在玻璃小瓶中，置于-80℃保存°C，且始终避光保存。合成 RAR 激动剂：Am80（Wako Chemicals，美国里士满）。