Competitive Homing-Assays auf Gut-trope T-Zell-Migration Study

Zusammenfassung

Competitive Homing Experimente erlauben die direkte Beurteilung der wandernde Eigenschaften von zwei verschiedenen Zellpopulationen in einem einzigen Mausklick. Hier veranschaulichen wir dieses Verfahren durch einen Vergleich der Migration von ex vivo generierten gut-tropic versus nicht-gut tropic T-Zellen.

Zusammenfassung

Um ihre Funktion ausüben Lymphozyten benötigen, um das Blut zu verlassen und wandern in verschiedenen Geweben im Körper. Lymphozyten-Adhäsion an Endothelzellen und Gewebe Extravasation ist ein mehrstufiger Prozess durch verschiedene Adhäsionsmoleküle gesteuert (Homing-Rezeptoren) auf Lymphozyten und ihre jeweiligen Liganden (Addressine) auf Endothelzellen ^{1 2} angezeigt ausgedrückt. Obwohl die Funktion dieser Adhäsionsrezeptoren teilweise untersucht werden können ex vivo, der ultimative Test für ihre physiologische Relevanz ist, ihre Rolle bei der In-vivo-Lymphozyten Adhäsion und Migration zu bewerten. Intravitalmikroskopie (IVM) und Homing-Experimente: Zwei sich ergänzende Strategien sind für diesen Zweck verwendet worden. Obwohl IVM war wesentlich an den genauen Anteil der spezifischen Adhäsionsrezeptoren während die Haftung Kaskade in Echtzeit und in verschiedenen Geweben zu definieren, IVM zeitaufwendig und arbeitsintensiv ist, ist es oft erfordert die Entwicklung von anspruchsvollen chirurgischen Techniken, braucht es vor Isolierung von homogenen Zellpopulationen und es erlaubt die Analyse von nur einem Gewebe / Organ zu einem bestimmten Zeitpunkt. Im Gegensatz dazu ermöglichen wettbewerbsfähige Homing Experimente die direkte und gleichzeitige Vergleich bei der Migration von zwei (oder sogar mehr) Zellpopulationen in der gleichen Maus und sie erlauben auch die Analyse von vielen Geweben und einer hohen Anzahl von Zellen in das gleiche Experiment.

Hier beschreiben wir die klassischen kompetitiven Homing-Protokoll verwendet, um den Vorteil / Nachteil eines bestimmten Zelltyp zu Hause, um spezifische Gewebe zu bestimmen, wie ein Steuerelement Zellpopulation verglichen. Wir entschieden uns für die Migration von gut-tropic gegenüber nicht gut-tropic T-Zellen zeigen, da die Darmschleimhaut ist die größte Körperoberfläche in Kontakt mit der äußeren Umgebung und es ist auch die extra-lymphatischen Gewebes mit den besten definierten wandernde Anforderungen . Darüber hinaus haben neuere Arbeiten festgestellt, dass die Vitamin-A-Metaboliten all-trans-Retinsäure (RA) die wichtigsten molekularen Mechanismus für die Induktion gut-spezifische Adhäsion Rezeptoren (Integrine a4b7and Chemokinrezeptor CCR9) auf Lymphozyten ist. So können wir ohne weiteres erzeugen eine große Anzahl von gut-tropischen und nicht gut-tropic Lymphozyten ex vivo durch Aktivierung von T-Zellen in Anwesenheit oder Abwesenheit von RA, bzw., was schließlich in der Wettbewerbssituation Homing hier beschriebenen Experimente verwendet werden.

Protokoll

1. Ex-vivo-Generation von gut-Homing und Kontrolle T-Zellen (siehe Abbildung 1)

1. Isolieren Splenozyten von Maischen ein Milz von Wildtyp-Mäusen. Resuspendieren der Zellen Suspension in PBS und zentrifugieren Sie für 5 'bei 400 x g. Entfernen Sie den Überstand und lysieren die roten Blutkörperchen durch Resuspendieren des Zellpellets in 4 ml ACK-Lysepuffer für 2-3 Minuten. Danach werden 5 ml PBS. Zentrifugieren Sie für 5 'bei 400 xg und entfernen Sie den Überstand.
2. Resuspendieren insgesamt Splenozyten bei 1 x 10 ⁶ / ml in IMDM + 10% FBS + 50 mM 2-Mercaptoethanol + Penicillin / Streptomycin (komplett IMDM). Trennen Sie die Zellen....

Diskussion

Obwohl Homing Experimente sehr wertvolle Informationen über die Migration des gesamten Zell-Populationen in einem bestimmten Gewebe zu schaffen, sollte es im Auge behalten werden, dass diese Tests nicht direkt analysieren endothelialen Adhäsion und daher nicht zu diskriminieren, in der Stufe (n) des mehrstufigen Haftung Kaskade (Tethering / Walz-, Aktivierungs-oder Kleben) eine gegebene Homing-Rezeptor wirkt. Der Goldstandard der spezifischen Rolle der Homing-Rezeptoren in die Haftung Kaskade zu definieren, ist Intravit.......

Materialien

Tiere: C57BL / 6 Mäuse werden häufig für T-Zell-Isolierung verwendet. Darüber hinaus sind CD45.1 und Thy1.1 kongene Stämme durch Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) zur Verfügung.

Kulturmedien: IMDM (Iscove-Modified Dulbecco Medium + L-Glutamin + Hepes) plus 10% Hitze-inaktiviertes FBS (fötales Rinderserum, niedrige Endotoxin, Gibco ®, Invitrogen, Carlsbad, CA) mit 100 U / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin (HyClone Antibiotika, Waltham, MA), 0,5 mg / ml Fungizone / Amphotericin B (Gibco) und 50 mM b-Mercaptoethanol.

ACK Red Blood Cell Lysis-Puffer (RBC, 10 mM KHCO _3, 150 mM NH ₄ Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0), auf pH 7,2-7,4 und bei Raumtemperatur lagern anpassen).

PBS (Phosphate Buffered Saline, Hyclone, Waltham, MA).

Durchflusszytometrie (FACS) Medien (PBS oder IMDM + 2% FBS + 5 mM EDTA). Wenn Färbung mit Selectin-Fc-Chimären, Medien mit 2 mM Ca ^{+ +} soll in allen Stufen (einschließlich FACS-Akquisition) verwendet werden. IMDM ist in diesem Fall empfohlen.

T-Zell-Kennzeichnung und adoptiven Transfer: CFSE (Carboxyfluoresceindiacetat, Succinimidylester), CMTMR ((5 - (und-6 )-((( 4-Chlormethyl) benzoyl) amino) Tetramethylrhodamin) von Molecular Probes ®, Invitrogen, Carlsbad, CA ). 1000 x Vorräte sollten in DMSO hergestellt werden (5 mM CFSE, 20 mM CMTMR) und bei -20 ° C.

Polyklonale T-Zell-Aktivierung: 24-well oder 96-well-Platten (Gewebe-Kultur behandelt, Polystyrol, mit flachem Boden mit Deckel, BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) für 2 Stunden bei 37 ° C mit 50 ml PBS, jeweils inkubiert , mit anti-CD3 und anti-CD28 Antikörper (10 mg / ml). Dann werden Kulturplatten zweimal mit PBS gewaschen und sofort für die T-Zell-Kultur verwendet. Alternativ können Dynabeads mit anti-CD3/anti-CD28 (Dynal, Invitrogen, Carlsbad, CA) beschichtet für T-Zell-Aktivierung statt Platte gebundene Antikörper verwendet werden.

Durchflusszytometrie (FACS) Färbung: polyklonale Aktivierung: CD3 (1452C11), CD28 (37,51). Lineage mAb: CD4 (L3T4), CD8a (Ly-2), Thy1.2 (CD90.2/53-1.2), CD45.2 (104). Gut-Homing-Rezeptoren: gereinigtes CCR9 (CD199/eBioCW-1.2, eBioscience, San Diego, CA), a4b7 (LPAM-1/DATK3), Isotyp-Kontrolle (IgG2a, k). Skin-Homing-Rezeptoren: P-Selektin-Fc (gereinigtes Maus P-Selectin - IgG-Fusionsprotein, BD Pharmingen, San Jose, CA), E-Selektin-Fc (rekombinantes Maus E-Selectin/Fc Chimera, R & D Systems, Minneapolis, MN) plus entsprechende sekundäre Reagenz Ziege F (ab ') 2 Anti-Human-IgG R-PE (Invitrogen, Carlsbad, CA).

All-trans-Retinsäure (Sigma, St. Louis, MO) wird in absolutem Ethanol oder DMSO mit einer gelben Glühbirne oder eine indirekte Lichtquelle während der Vorbereitung resuspendiert. Shop-Aliquots in Glasflaschen bei -80 ° C und vor Licht geschützt zu allen Zeiten. Synthetische RAR-Agonisten: AM80 (Wako Chemicals, Richmond, VA).