Summary
Conhecimento do número exato de células viáveis é necessário para muitos manipulações cultura de tecidos. Este protocolo descreve como diferenciar entre células vivas e mortas e quantificar as células usando um hemocitômetro. Embora contando descreve-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), ele pode ser usado para outros tipos celulares.
Abstract
Conhecimento do número exato de células viáveis em um determinado volume de uma suspensão de células é necessária para muitas manipulações de rotina de cultura de tecidos, como células de revestimento para imunocitoquímica ou para transfections celular. Este protocolo descreve um método simples e rápido para a diferenciação entre as células vivas e mortas e quantificar a concentração de células eo número total de células usando um hemocitômetro. Este primeiro procedimento requer destacando as células de uma superfície de crescimento e ressuspensão na mídia. Em seguida, as células são diluídas em uma solução de Trypan azul (de preferência a uma concentração que vai dar 20-50 células por quadrante) e colocado no hemocitômetro. Finalmente, a média das contagens de células viáveis em vários quadrantes selecionados aleatoriamente, dividindo a média do volume de um quadrante 1 mm 2 (0,1 mL) e multiplicando pelo fator de diluição dá o número de células por l. Multiplicando este concentração celular pelo volume total em mL dá o número total de células. Este protocolo descreve contando-tronco neurais humanas / precursor células (hNSPCs), mas também pode ser usado para muitos outros tipos celulares.
Protocol
Passaging células-tronco neurais
Nota: Consulte o Neural Stem Passaging células artigo sobre como separar e ressuspender as células. https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263
Preparar a suspensão de células de Contagem
- ML 25 lugar de 0,4% solução azul Trypan e 20 l de mídia celular em um tubo eppendorf.
- Ressuspender as células a serem contadas batendo o tubo que contém as células em um volume conhecido de mídia para criar uma suspensão homogênea. Colocar 5 mL de células dentro do tubo eppendorf da etapa anterior. Esta etapa dilui a concentração de células por um fator de 10.
- Coloque a tampa de vidro sobre o hemocitômetro e carregar sobre 11-12 mL da suspensão de células.
Contagem de células no hemocitômetro
- Observar toda a grade do hemocitômetro em um microscópio de contraste de fase. Concentre-se em um quadrante da grade (como a de vermelho).
- Células mortas ou morrendo aparecerá azul por causa de sua membrana foi danificado e não são capazes de excluir o corante azul Trypan. Células viáveis não aparecerá azul e será rodeado por um "halo" de luz em contraste de fase (será "fase brilhante").
- Contar o número de células viáveis em um quadrante (área 1 mm 2). Você também pode determinar a viabilidade celular pela divisão do número de células viáveis pelo número total de células. Contagem de células em 04/03 quadrantes aleatórios e determinar o número médio de células por quadrante. Como o volume de um quadrante é conhecido por ser 10 ml ou 0,1 mL -4, a concentração de células pode ser determinada
- Você pode usar o atalho a seguir para determinar as células # / mL:
Número total de células em tubos = # células / mL X mL em tubo
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Discussion
Este protocolo descreve uma maneira simples e rápida para determinar a concentração de células para uma variedade de experiências envolvendo células. Usando o atalho descritas em 3d, pode-se rapidamente e determinar com precisão a concentração de células eo número total de células em um determinado volume.
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Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer o Dr. Philip H. Schwartz da Célula de Recursos Humanos Neural Stem Nacional do Hospital Infantil s, Orange County Instituto de Pesquisa para a prestação de culturas hNSPC.
Materials
Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
Phase Contrast Hemacytometer | Tool | Hausser Scientific | 02-671-54 | Distributed by Fisher under the indicated catalog # |
Trypan Blue Stain 0.4% | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15250-061 | Distributed by Invitrogen under the indicated catalog # |
References
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Caprette, D. avidR.
Using a Hemacytometer. BioEd Online. , http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer&dpg=3 (2008). - Caprette, D. avidR.
Counting Chamber (Hemacytometer). BioEd Online. , http://www.bioedonline.org/slides/slide01.cfm?q=%22hemacytometer%22&dpg=2 (2008).