लंबी दूरी की डीएनए सहभागिता की पहचान के लिए एसोसिएटेड क्रोमोजोम जाल
Summary
संबद्ध गुणसूत्र जाल परख (अधिनियम) लंबी दूरी की डीएनए बातचीत की पहचान करने के लिए एक उपन्यास विधि निष्पक्ष है. लंबी दूरी डीएनए बातचीत के लक्षण वर्णन हमें दोनों सामान्य शरीर विज्ञान में और रोगग्रस्त राज्यों में परमाणु वास्तुकला का संबंध जीन की अभिव्यक्ति के लिए निर्धारित करने के लिए अनुमति देगा.
Abstract
आनुवंशिक डीएनए द्वारा इनकोडिंग जानकारी एक जटिल और उच्च विनियमित chromatin संरचना में आयोजित किया जाता है. प्रत्येक गुणसूत्र के एक विशिष्ट क्षेत्र में रह रहे हैं, कि विकास की अवस्था या कोशिका चक्र के अनुसार बदल सकते हैं. जीन अभिव्यक्ति विशेष transcriptional कारखानों में हो सकता है जहां chromatin क्षेत्रों गुणसूत्र के विभिन्न प्रदेशों से बाहर पाश डीएनए खंडों जो अलग या एक ही गुणसूत्र पर गुणसूत्रों दूर पर मौजूद हो सकता है की सह स्थानीयकरण करने के लिए अग्रणी हो सकता है. एसोसिएटेड क्रोमोजोम ट्रैप परख (अधिनियम) एक प्रभावी पद्धति के विस्तार और गुणसूत्र रचना पर कब्जा तकनीक को संशोधित करके इन लंबी दूरी की एक निष्पक्ष फैशन में डीएनए संघों की पहचान प्रदान करता है. अधिनियम परख के लिए यह संभव बनाता है हमें ट्रांस में transcriptional विनियमन के तंत्र की जांच करने के लिए, और परमाणु वास्तुकला का सामान्य और रोग राज्यों के दौरान शरीर क्रिया विज्ञान में जीन अभिव्यक्ति के रिश्ते को समझाने में मदद कर सकते हैं.
Protocol
Discussion
डेकर एट अल. गुणसूत्र रचना कब्जा दृष्टिकोण (3C) विकसित करने के लिए दो जीनोमिक loci 1 के बीच बातचीत की आवृत्ति का पता लगाने, और 3C बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है दो स्तनधारी 2 कोशिकाओं में ज्ञात डीएनए क्षेत्रों के बीच अंतर गुणसूत्र और अंतर – गुणसूत्र संघों की जांच -9. हालांकि नव विकसित हाय – सी पद्धति जीनोम चौड़ा डीएनए संघ के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है, अधिनियम परख अभी भी ठिकाना विशिष्ट डीएनए 10-11 बातचीत के अध्ययन के लिए एक प्रभावी तकनीक है. हम इस दृष्टिकोण को संशोधित किया है कि सभ्य माउस और मानव कोशिकाओं (चित्रा 1) में एक ज्ञात डीएनए क्षेत्र के साथ जुड़े रहे हैं अज्ञात डीएनए क्षेत्रों की पहचान. हम जुड़े गुणसूत्र जाल परख (अधिनियम) इस पद्धति का नाम है, क्योंकि यह हमें एक विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि उपन्यास अज्ञात डीएनए भागीदार है कि एक ज्ञात लक्ष्य डीएनए 12 क्षेत्र के साथ सहयोगी की पहचान प्रदान की. उचित नियंत्रण के साथ एक सफल 3C परख अधिनियम 13 परख के उपन्यास पहलुओं को क्रियान्वित करने से पहले किया जाता है. कई संभव के रूप में जुड़े डीएनए क्षेत्रों के रूप में tofind क्रम में, यह पहली और दूसरी प्रतिबंध एंजाइमों के विभिन्न संयोजनों का उपयोग करने के लिए आवश्यक है. यह विशेष रूप से प्रतिबंध एंजाइमों कि CPG मेथिलिकरण के लिए असंवेदनशील पहली 3C ligation कदम प्रदर्शन कर रहे हैं का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है. प्रोटीन बंधन और डीएनए मेथिलिकरण भी प्रतिबंध एंजाइम पाचन दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं और जुड़े कुछ प्रतिबंध एंजाइम digestions के लिए डीएनए क्षेत्रों के ligation की विफलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. अंतर या अंतर – गुणसूत्र ligation की घटना प्रोटीन डीएनए पार से जोड़ने और जुड़े डीएनए क्षेत्रों में दोनों के उचित शारीरिक नक्शे पर निर्भर करता है. इस प्रकार, कुछ प्रारंभिक प्रयोगों अधिनियम परख में एक साध्य प्रभावी formaldehyde एकाग्रता और उपचार समय की स्थापना के लिए आवश्यक हैं. Formaldehyde (from1.5% से 2%) के अंतिम सांद्रता का एक सीमा 7,9 परख के 3C भाग के दौरान कई प्रयोगशालाओं में इस्तेमाल किया गया है. वैकल्पिक रूप से, linkers के रूप में इस्तेमाल किया oligonucleotides एकजुट दूसरी प्रतिबंध एंजाइम द्वारा काट अंत मैच बनाया जा सकता है है. हालांकि हमने पाया है कि पीसीआर के दूसरे दौर में पीसीआर और 20-25 चक्र के पहले दौर में 18-20 चक्र स्पष्ट बैंड प्रदान कर सकता है, यह आवश्यक है कि प्रत्येक प्रयोग (चित्रा 2) के लिए सबसे अच्छा पीसीआर स्थितियों स्थापित इंट्रा अणु. 5'-अंत और 3'अंत एक कतरा डीएनए पीसीआर में हो सकता है की पूरक एडाप्टर अनुक्रम के बीच annealing एडाप्टर विशिष्ट डीएनए अणु के साथ annealing प्राइमर रोकता है, और पहले कई चक्रों में बहुत कम प्रवर्धन दक्षता में हुई. बाद लक्ष्य डीएनए चक्र के लिए परिलक्षित किया गया था, अपनी राशि ज्यादा इन nonspecific प्रतिक्रियाओं से भी बड़ा हो, और हो सकता है प्राइमर लक्ष्य डीएनए अणु के लिए annealing की प्रतियोगिता की सुविधा हो सकती है. यह भी है इसलिए हम पृष्ठभूमि प्रवर्धन देखते हैं, कर सकते हैं और पहले दौर पीसीआर उत्पाद पृष्ठभूमि amplification.It कमी पतला हो गया है महत्वपूर्ण है के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया से अधिक प्राइमरों को हटाने क्रम में पीसीआर के दूसरे दौर में पृष्ठभूमि में कमी क्यों है. सभी पीसीआर आधारित प्रयोगों के रूप में, यह महत्वपूर्ण है कि दोहराने अनुक्रम क्षेत्रों, जो मानव और चूहे डीएनए के बहुमत का गठन में स्थित नहीं हैं प्राइमरों डिजाइन. हालांकि नव विकसित हाय – सी पद्धति जीनोम चौड़ा डीएनए संघ के अध्ययन के लिए लागू किया जा सकता है, अधिनियम परख अभी भी ठिकाना विशिष्ट डीएनए बातचीत के अध्ययन के लिए एक प्रभावी तकनीक है.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Adelle Murell और वुल्फ Reik उनके 3C प्रोटोकॉल साझा करने के लिए बहुत बहुत धन्यवाद. इस काम के रक्षा और दिग्गजों मामलों के विभाग के अनुसंधान सेवा के विभाग द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| RPMI1640 medium | Invitrogen | 22400-105 | ||
| acrylamide | Invitrogen | 15512-023 | ||
| ATP solution, 10mM | Invitrogen | AM8110G | ||
| fetal bovine serum | Invitrogen | 16000-044 | ||
| penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| 1M Tris pH8.0 | Invitrogen | AM9856 | ||
| RNase A | Invitrogen | 12091-039 | ||
| SDS | Invitrogen | 15525-017 | ||
| urea | Invitrogen | 15505-035 | ||
| BamH I | NEB Biolabs | R0136T | ||
| Bgl II | NEB Biolabs | R0144M | ||
| Dpn II | NEB Biolabs | R0543T | ||
| Msp I | NEB Biolabs | R0106S | ||
| dNTPs | NEB Biolabs | N0447L | ||
| proteinase K | NEB Biolabs | P8102S | ||
| T4 DNA ligase | NEB Biolabs | M0202T | ||
| 37% formaldehyde | Sigma-Aldrich | F8775 | ||
| Bis-acrylamide | Sigma-Aldrich | 146072 | ||
| dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | ||
| glycine | Sigma-Aldrich | 50046 | ||
| PMSF | Sigma-Aldrich | 93482 | ||
| proteinase inhibitor | Sigma-Aldrich | S8830 | ||
| Nonidet P-40 | Roche Applied Science | 11754599001 | ||
| KlenTaq1 | Ab peptides | 1001 | ||
| dCTP alpha P32 | PerkinElmer | BLU513H250UC | ||
| PTC-100 Thermal Cycler | MJ Research | mjptc100 | ||
| Power Supply | Bio-Rad | 164-5056 | ||
| OmniPAGE Maxi | Aurogene Life Science | VS20D | ||
| Typhoon 9400 | GE Healthcare | 63-0055-78 |
References
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