ロングレンジDNAの相互作用を識別するための関連する染色体のトラップ

Summary

関連する染色体のトラップ（ACT）アッセイは、長距離DNA相互作用を同定するための新たな方法です。長い範囲のDNAの相互作用の特徴付けは、私たちは両方の通常の生理機能と疾患状態における遺伝子発現への核アーキテクチャの関係を判別することができます。

Abstract

DNAによりコードされる遺伝情報は、複雑かつ高度に規制クロマチン構造に編成されています。各染色体は、開発や細胞周期の段階に応じて変更される可能性がある特定の地域を、占めている。遺伝子発現は、同じ染色体上に離れて別の染色体上に存在するかことができるDNAセグメントの共局在につながるクロマチンのセグメントは、様々な染色体の地域からループアウトすることが、専門的な転写工場で発生することができます。関連する染色体のトラップ（ACT）アッセイは、染色体のコンフォメーションキャプチャ技術を拡張し、変更することで、公平な方法でこれらの長期的なDNAの関連付けを識別するための効果的な方法論を提供します。 ACTのアッセイは、私たちはトランスの転写調節のメカニズムを調査することが可能になります、そして通常の生理機能および疾患状態における遺伝子発現への核のアーキテクチャの関係を説明するのに役立ちます。

Protocol

1。長距離クロマチンの相互作用のホルムアルデヒド固定インキュベーターで15％FBSおよび80〜90％コンフルエントに1 ×ペニシリン/ストレプトマイシンと培養ヒト細胞株RPMI1640培地でHL – 60は37℃、5％CO 2に付属℃に 15分間1200 rpmで50 mlのヌンクチューブ、遠心中に細胞を回収し、吸引により培地を除去細胞ペレットを再懸濁させる培地5 mlを加えて、血球計算盤を用いて細胞を数える。 RPMI1640 / 10％FBSを有する40mlの容積に約1 × 10 7細胞を利用し、希釈クロマチンを修正するために37％ホルムアルデヒド1.7mlを加える。 穏やかに振盪しながら室温で10分間インキュベートし、2Mグリシンの2.4 mlを癒やす。 4時1200 rpmで15分間、遠心° C、そして上清を取り除く。 40ミリリットルの氷冷PBSで1回ペレットを洗浄し、ペレットをスピンダウンし、PBSを取り除く。 2。核を分離するために細胞溶解新鮮な追加プロテアーゼ阻害剤（1:500希釈）と0.1mMのPMSFと氷冷溶解バッファー（10mMのトリス- HCl、pH8.0、10mMのNaClを、0.2％NP – 40）40ml中の再懸細胞。 90分、15分間2,500 rpmで遠心分離の回転と寒い部屋でインキュベートし、上清を取り除く。 3。 Bgl IIで制限酵素消化 1 × NEBバッファ3の0.5mlに核を再懸濁し、15μlof10％SDSを加える。振盪しながら1時間、37℃でインキュベートし、その後、トリトンX – 100 SDSを隔離するために20％の45μlを加える。 ℃で1時間振とうしながら37℃でインキュベートする。 制限酵素消化のための1 × 10 6細胞核（約15μgの、元の細胞の10分の1）のアリコートを使用してください。ステップ3.1から核のソリューションの55μlを取り出し、1 × NEBバッファ3 および Bgl II（50U/ul）の12μlの433μlを500μlのために作る。 37℃で一晩インキュベートする。 4。相互作用するDNAセグメントのライゲーション 65で加熱することにより95 10％SDSの添加、および変性を追加することにより、制限酵素を失活℃の水浴で20分間。 1 ×ライゲーション緩衝液（30mMのトリス- HCl、pH 8.0、10mMのMgCl 2、10mMのDTT、1mMのATP）と20％のTriton X – 100の360μlを7 mlを加え、1時間37℃でインキュベート。 16 ° Cおよび400 U /μlのT4 DNAリガーゼを50μlを追加して温度を下げる。室温で30分間後、4時間16℃でサンプルをインキュベートし。 5。 DNA精製プロテイナーゼK300μgのを追加し、65℃で一晩。 37とインキュベート℃で30分間、RNaseの5μgを追加するイソプロパノールのフェノール/クロロホルム抽出、及び沈殿物のDNAでDNAを精製する。滅菌蒸留水150μlのDNAを溶解する。 6。 MSP Iによる消化およびオリゴヌクレオチドリンカーとライゲーション 4〜6時間で37 MSP私の5単位で° CのDNAを精製したの2μgをインキュベートする。 65歳で私をMSP℃で10分間を不活性化し、5 mg / mlのグリコーゲンを1μlとエタノールでDNAを沈殿させる。滅菌蒸留水50μlにDNAペレットを溶解する。 20μMのリンカーオリゴヌクレオチドのL（5' – gctgaccctgaattcgcacgtgcctgtcgttagcggacacagggcgattcac – 3'）を2μl、20μMのオリゴヌクレオチドS（5' – cggtgaatc – 3を1μl"）、1μlのとMSP I処理したDNAを50μlを混合滅菌蒸留水と10 × T4 DNAリガーゼバッファーの6μlの。液体ワックスとの混合物をカバーしています。 50変性オリゴヌクレオチド℃で1分間Cとサーマルサイクラーで° C 0.5 ° C /分の勾配を10に徐々に冷却します。 400 U /μlのT4 DNAリガーゼ1μlを加え、15℃で一晩インキュベートする。 QIAクイックPCR精製キットを使用してリンカーライゲーションされたDNAを精製し、滅菌蒸留水50μlで溶出。 7。 PCR増幅と配列分析あなたが長距離相互作用（すなわち、"餌"）のために検査したいDNAの特定の領域のプライマーを選択してください。この例では、我々は、ABL – 1を使用してください。 最初のラウンドのPCRは、20μMABL -1特異的プライマー＃4656（5' – gttcaagcgattctcctgcctcga – 3'）、20μMのリンカー特異的プライマー＃2963（5' – 1μlの1μlを使用してを実行するために精製したDNA 1μlを取るgctgaccctgaattcgcacgtgcct – 3'）、3 × Klen Taq DNAポリメラーゼIカクテルと滅菌蒸留水を3μlの3μl。 32 P – dCTPの二つμlのPCR増幅の前に私はカクテル3 × Klen Taq DNAポリメラーゼの100μlに添加される。ホットスタートPCRは2分間、95℃CFOR 2分間72℃であるため、熱サイクル、95の18サイクルで20秒間、65℃40秒C、1分間72℃で、最終的な拡張72 ° Cで行われ5分間。 滅菌蒸留水30μlにQIAクイックPCR精製キット、溶出したDNAを用いて最初のラウンドのPCR産物を精製する。 20μMのABL – 1特異的プライマー＃4626（5' – ggagaatttttatctgcctctgtga – 3'）（図1a）、1μlの1μLを加えることによって入れ子プライマーを用いたPCRの第2ラウンドを行うために100 ×希釈した最初のPCR産物を1μlを取るリンカー特異的プライマー＃2961（5' – gtcgttagcggacacagggcgattc – 3'）、滅菌蒸留水の添加3 × Klen Taq DNAポリメラーゼ私はカクテルと3の3μlの20μMの。サーマルサイクリングのスケジュールは、20秒、95℃、67℃40秒、72で拡張子が続く1分、℃で5分間72℃での25サイクルです。 5パーセント尿素- PAGEゲルを実行するとPhosphoImager（図1b）にさらさ画面を走査することによりPCR産物を可視化する。それぞれのPCRバンドを滅菌蒸留水60μlを含むエッペンドルフチュー​​ブにゲル片を溶解し、℃で5分間95℃インキュベートすることにより、ゲルからリサイクルすることができます。すべてのサンプルを収集するために10秒間、10,000 rpmで短時間遠心します。上記と同じ条件を使用して、プライマー対4626分の2961でPCRを実行するためにDNAの鋳型として使用する場合、1μlを取り外します。配列解析をQIAquick PCR精製キットを用いて精製した後に実行することができます。 http://genome.ucsc.edu（図1c）：DNA配列は、ウェブサイトでそれらの染色体位置を決定するオンラインツールを用いて分析している。 DNA配列を貼り付けることができる新しいウィンドウを入力して"​​BLAT"をクリックして、新しいウィンドウが'submit'をクリックした後に表示され、"BLATの検索結果を"示しています。 DNA配列の位置を示すために次のウィンドウに入力する100％の同一性で大ヒットの"ブラウザ"をクリック。 8。代表的な結果 1。その長い範囲のDNAの相互作用を決定するために餌としてABL – 1の領域を使用してACTアッセイ図1a、二つの BglII部位一BamHIでサイトに示すように、ACTアッセイのために選ばれた。 PCRの第2ラウンドでは、プライマーは、2961分の4626は、ABL – M1を増幅するために使用されたセット、2961分の4630は、ABL – M2に使用され、2961分の4636は、ABL – M3のために使用されていました。典型的なゲルのパターンはいくつかのバンド（図1b）への1つを示しています。 ACTアッセイの各フラグメントは、2つの結合されたDNAセグメントで構成されています：第2セグメントは第一の制限酵素認識配列によって餌域セグメントに結合された関連するパートナー、から来る間、一つのセグメントは、餌のDNA領域から導出されます。第二の酵素の認識配列は、関連付けられているパートナーのシーケンス（図1c）の最後に表示されます。クローン化されたABL – M1フラグメントは+133,592,306-133,592,399から染色体9q32.4に位置するABL1の領域からのDNAが含まれており、関連するパートナーは+71,869,882-71,870,107から染色体3p13に位置しています。関連するパートナーのアイデンティティがUCSCゲノムブラウザ（2009年2月にリリースさGRCh7/hg19）を使用して、それらの配列をブラストによって発見されています。PROK2は chr3p13座での関連するパートナーとして同定された。 クローンABL – M3は、ABL – 1遺伝子座に近い内染色協会として同定された一方同様に、ABL – M2関連したパートナーは、chr5q21.1に局在していた。 2。 ACTアッセイを用いて有病率の低下長距離相互作用の決定 3Cに基づいて他のアッセイは、我々は図1に及びIGF2 / H19座12で示されているよりも多くの相互作用のパートナーを報告している。我々が概説されていることを方法論は、最も一般的な長距離相互作用を選択します。しかし、PCRのサイクル数を増やすことによって、それがよく（図2）に応じて追加、それほど頻繁にアソシエーションを識別することが可能です。 3。正常組織に比べ癌細胞における長距離相互作用の違い。 ACTアッセイはまた、核の構造と正常細胞とがん細胞（図3）との間の長距離相互作用の違いを識別するために使用することができます。これらの違いは、細胞形質転換時に発生する核のアーキテクチャの変更を反映することができるため、このアッセイは、最終的には診断目的のために適用可能である。正常および癌組織の両方で発生する同様のゲルパターンは、ACTアッセイの信頼性と再現性であることが示された。 ACTアッセイは、長い範囲のDNAのパートナーを識別できますが、そのようなフィッシュ＆チップスアッセイなどのさらなる分析は、、遠い遺伝子座の間に同定されたアソシエーションの存在を確認する必要があります。遺伝学的、生理学的および生化学的研究は、これらの長い範囲のDNA協会の生物学的影響を解明するために実行することができます。 HL – 60細胞での餌のDNAとして、ABL – 1領域を用いて図1のACTアッセイ 。 A. DNA構造体ABL – 1領域のURE。 ACTアッセイで使用されている最初の制限酵素はBglIIでいました。 PCRの第2ラウンドのためのプライマーも矢印と対応するプライマーの番号によってラベル付けされます。 B. 5パーセント尿素- PAGEにおけるACTアッセイのゲルパターン。プライマーペア4626/2961は、ネステッドPCRでABL – M1クローンを増幅するために使用され、2961分の4630は、クローンABL – M2に使用され、2961分の4636は、クローンABL – M3のために使用されていました。 C.クローンABL – M1のDNA配列。 ABL – 1餌のDNAからDNA断片が赤でラベル付けされている、と関連付けられているDNAのパートナーがシアンでラベル付けされている。 をBgl IIサイト（AGACTC）緑色に標識された、とMSP私のサイトは（CCGG）紫色のラベルが貼られています。 図2のPCRサイクルは、ACTアッセイの結果に影響を与える。マウス線維芽細胞における餌のDNAとしてIgf2/H19座でインプリンティング制御領域（ICR）を使用して、別のサイクリングプログラムはACTアッセイのPCRの第1,2ラウンドに分けて適用されていました。 PCRの最初のラウンドで18から20サイクルは、可視化するのに十分な信号を増幅していませんでした。明確なバンドの第二のPCRの結果で二十5サイクル、PCRの第2ラウンドのためにサイクル数を増やしながら、よりバンドに加えて、スミアのパターンを誘導した。 ACTアッセイの正常な結腸組織と結腸癌組織間の核アーキテクチャの違いを図3検出。A. ACTアッセイのためのDNA IGF2/H19軌跡とIGF2遺伝子におけるICR領域の構造。DPN II部位が標識されている。第二ラウンドPCRに用いるプライマーは、図のパネルBの各レーンに対応するさまざまな色の矢印と数字でラベルが付いています。 B. 5パーセント尿素- PAGEにおけるACTアッセイのゲルパターン。正常な結腸組織MAD03 – 1423および大腸癌組織MAD04 – 149は協調ヒト組織ネットワーク（CHTN）西部事業部から入手した。各結腸組織をホモジナイズした後、ACTアッセイは、本明細書に記載の手順に従って実施した。レーン1はプライマーペア＃2961andのパネルにピンク色で標識された＃4161を（5' – tctgcgccatcagggcagtgagac – 3'）を用いたPCRの結果を表し、レーン2はプライマーペア＃2961と＃4163（5' – gccgcgcggccacttccgattcc – 3を用いたPCRの結果を表します。 "）パネルで、オレンジ色のラベルが付いて、レーン3は、プライマーペア＃2961と＃5145（5' – gccatgcaggtaggatttgagctg – 3を用いたPCRの結果を表します"パネルに青色でラベルされた）、レーン4はプライマーペア＃2961を用いたPCRの結果を表します。パネルaに緑で標識されたと＃5151（5' – gtctcaaataggggccagctagcttgg – 3'）正常な結腸組織にのみ現れるユニークなバンドは黄色の矢印で表示されています、と大腸癌組織にのみ登場したそれらのバンドは赤色の矢印で表示されています。 ICR、刷り込み制御領域、DMR、異なるメチル化領域。

Discussion

デッカーら二つのゲノム遺伝子座¹の間の相互作用の頻度を検出するために染色体のコンフォメーションキャプチャ（3C）のアプローチを開発し、3Cは、哺乳類細胞内の2つの既知のDNA領域²間のイントラ染色体と間染色体の関連を調査するために広く用いられている^-9。新開発のHi – Cの方法論は、ゲノムワイドなDNA関連の研究に適用することができますが、ACTアッセイは、まだ遺伝子座特異的DNA相互作用^10-11の研究のための有効な手法です。我々は、培養マウスとヒトの細胞（図1）の既知のDNA領域に関連付けられている未知のDNA領域を識別するために、このアプローチを変更しました。それは私たちに知られている標的DNA領域¹²に関連付ける新規の未知のDNAのパートナーを識別するために、信頼性と再現性のある方法を提供するように我々は、関連する染色体のトラップ（ACT）アッセイは、このメソッドの名前。適切なコントロールを備えた成功3Cアッセイは、ACTアッセイ¹³の小説の側面を実行する前に実行されます。できるだけ多くの関連するDNA領域としてtofindためには、それは第1および第2の制限酵素の様々な組み合わせを使用する必要があります。それは、最初の3Cライゲーションのステップを実行するためのCpGメチル化へと小文字を区別しない制限酵素を使用することが特に重要です。タンパク質の結合とDNAメチル化はまた、制限酵素消化の効率に影響を与えることができますし、特定の制限酵素消化のために関連するDNA領域のライゲーションの失敗につながることができます。イントラまたはインター染色ライゲーションの発生は、タンパク質- DNA架橋と関連するDNA領域の両方の適切な物理的な地図に依存する。このように、いくつかの予備実験では、ACTアッセイで実用的な効果的なホルムアルデヒドの濃度と処理時間を確立するために不可欠です。ホルムアルデヒド（from1.5％〜2％）の最終濃度の範囲は、アッセイ^7,9の3C部分の間にいくつかのラボで使用されている。また、リンカーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、2番目の制限酵素によって切断付着末端と一致するように設計することができます。我々はPCRの第2ラウンドのPCR 20〜25サイクルの最初のラウンドで18から20サイクルが明確なバンドを提供することができることがわかったが、それはそれぞれの実験（図2）のための最高のPCR条件を確立することが必要です。イントラ分子DNA鎖はPCRで発生する可能性の5'末端および3'末端の相補アダプター配列の間のアニーリング、それは、DNA分子とのアニーリングアダプター特異的プライマーを阻害し、最初の数サイクルではるかに低い増幅効率が得られた。ターゲットDNAがサイクルで増幅した後、その量は、これらの非特異的反応よりもはるかに大きくなる可能性、およびターゲットDNA分子にアニーリングプライマーの競争を促進するかもしれない。これは、我々はバックグラウンドの増幅が表示されることがあります理由もあり、なぜ最初のラウンドのPCR産物は、バックグラウンドのamplification.Itを減少させるために希釈する必要があると、PCRの第2ラウンドでバックグラウンドを減少させるためにPCR反応からの過剰なプライマーを除去することが重要です。すべてのPCRベースの実験のように、それはヒトとマウスのDNAの大部分を構成する反復配列領域に位置されていないプライマーを設計することが不可欠です。新開発のHi – Cの方法論は、ゲノムワイドなDNA関連の研究に適用することができますが、ACTアッセイは、まだ遺伝子座特異的DNA相互作用の研究のための有効な手法です。

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
RPMI1640 medium		Invitrogen	22400-105
acrylamide		Invitrogen	15512-023
ATP solution, 10mM		Invitrogen	AM8110G
fetal bovine serum		Invitrogen	16000-044
penicillin-streptomycin		Invitrogen	15140-122
1M Tris pH8.0		Invitrogen	AM9856
RNase A		Invitrogen	12091-039
SDS		Invitrogen	15525-017
urea		Invitrogen	15505-035
BamH I		NEB Biolabs	R0136T
Bgl II		NEB Biolabs	R0144M
Dpn II		NEB Biolabs	R0543T
Msp I		NEB Biolabs	R0106S
dNTPs		NEB Biolabs	N0447L
proteinase K		NEB Biolabs	P8102S
T4 DNA ligase		NEB Biolabs	M0202T
37% formaldehyde		Sigma-Aldrich	F8775
Bis-acrylamide		Sigma-Aldrich	146072
dithiothreitol		Sigma-Aldrich	43815
glycine		Sigma-Aldrich	50046
PMSF		Sigma-Aldrich	93482
proteinase inhibitor		Sigma-Aldrich	S8830
Nonidet P-40		Roche Applied Science	11754599001
KlenTaq1		Ab peptides	1001
dCTP alpha P32		PerkinElmer	BLU513H250UC
PTC-100 Thermal Cycler		MJ Research	mjptc100
Power Supply		Bio-Rad	164-5056
OmniPAGE Maxi		Aurogene Life Science	VS20D
Typhoon 9400		GE Healthcare	63-0055-78