これは、目的、操作、そして斬新な重力の分光計からの代表的な結果を示すステップバイステップガイドです。
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この記事について
サマリー
要約
巨大分子構造の研究は、分子機構と機能の解明に重要になっています。タンパク質の構造的特徴の力依存性をテストできるいくつかの限られた、しかし重要なbioinstrumentsがあります。規模は、研究者がそのような核酸、酵素、および生命維持の作業を実行するモータータンパク質などの分子のナノの世界を覗きできるか正確に上に制限するパラメータとなっています。原子間力顕微鏡（AFM）はよく電子顕微鏡と同等の距離分解能で繊維状のタンパク質のネイティブ構造を決定するために調整されています。しかし、AFMの力の研究で、軍は通常、単一の分子よりもはるかに高くなっています1、2を発生する可能性があります。光学トラップ（OT）がトラップされたビーズとの間の相対距離を判断するに非常に優れていると、彼らは非常に小さな力3を付与することができる。しかし、彼らが検討されて分子の正確な絶対的な長さを得ることはありません。分子シミュレーションは、実験に協力的な情報を提供しますが、同じ大規模な分子サイズ、長いタイムフレームを、処理し、他の証拠2、4の存在下でいくつかの研究者を説得する能力に制限されています。
重力分光計（GFS）は、能力のユニークな組み合わせを提供することにより、研究者の武器庫での重要なニッチを埋める。この楽器は、femtonewtonの範囲からnanonewtonの範囲に98％以上の精度で一般的に力を生成することができます。距離の測定は、現在、光トラップと同様の精度で5ナノメートル、そして相対的なビーズペアの分離距離に絶対的な分子の長さを解決する能力があります。また、GFSは、ストレッチや力が平衡に近い場所uncoilingを決定する、または任意の測定の構造変化に対して並置する段階的な力を提供することができます。それは生理的な力の負荷2でイベントをuncoilingに関与しているか、多くのアミノ酸残基を決定することも可能です。あらゆるアッセイを先行しなければならない大きな力のキャリブレーションが存在する他の方法とは異なり、GFSはそのような力のキャリブレーション5を必要としません。他の方法の強みを補完することで、GFSは重要な蛋白質と他の高分子のナノメカニクスを理解する上でのギャップをブリッジします。
プロトコル
新規GFSの構成の概要
定期的な光学顕微鏡、赤道儀、カメラ、およびコンピュータ[図1]：GFSは、いくつかの不可欠なコンポーネントで構成されています。サンプルを保持する密閉型フローセルのチャンバーは、GFSのデザインに応じて不可欠である。範囲は宇宙の別の方向に回転させることができるので、光学顕微鏡は、赤道儀に装着される。この能力は、重力の静的なベクトルは重力の力が試料にpiconewtonレンジの力の負荷を与えることができるので、サンプルはベクトルに関連して動的に配向させることができるように悪用されることができます。それはサンプルの向きの変化を記録できるようにカメラは、光学顕微鏡の接眼レンズに置き換えられます。この生データをデジタル化し、実際の力と距離の測定にデータを解釈するコンピュータによって操作されます。密封されたフローチャンバーは、試料を失うことなく空間中の全自由度をできるように設計されています。チャンバー内チャンバーの表面に接着され、"アンカー"ビーズに一方の末端近くにつながれているサンプルの分子が存在する。反対側の末端は、チャンバーの表面から自由である"モバイル"ビーズにつながれている。それは、それによってこのような低荷重負荷時のテザー分子を伸ばし重力によって処理することができるアッセイバッファー内の空きこのモバイルビーズである[図2]。それは、両方のビーズは、フローチャンバーの表面の上に座っているペアから分子への付着によって結合良好な使用可能なペアを識別するためにいくつ....
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ディスカッション
デジタル閾値表現にムービーを変換する場合、それはビデオの各フレームで同じ領域を維持するために閾値画像のための非常に重要です。ビーズペアのビーズは、互いに独立して移動するので、閾値領域でのドリフトも、大きな誤差を漂流して紹介するビーズの重心間の相対距離を引き起こす可能性があります。しきい値領域を制御することダウンは5nm〜26 nmの距離の測定値の5倍の誤差を減少させた。また、距離と力の値の両方をもたらす最終的な計算に重要であるビーズの間の比率として、両方のビーズの正確な半径の測定値を得ることが重要です。
システムは多くの方法で変更することができます。最新のシステムでは、バネ定数に対して全体GFSをドロップすることで、係留分子に段階的な力を与える。バネ定数が決定されると、三人称のビデオは、顕微鏡の映像が撮影され、2つが一緒に同期されていると同時に得ることができます。その後、顕微鏡のカメラからの映像の各フレームは、それは三人称、同期化映画の中でドロップされるようにGFSの位置に応じて力の値を指定することができます。ビデオの各フレームには、モバイルビーズは、秋と春のシステムのその後のリバ.......
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開示事項
利害の衝突は宣言されません。
謝辞
この材料は、グラント番号0842736の下で全米科学財団によってサポートされている作業に基づいています。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 3-アミノプロピルトリエトキシシラン | Polysciences, Inc. | 919-30-2 | |
| アセトン | Fisher Scientific | A18P-4 | |
| ピリジン | Sigma-Aldrich | 110-86-1 | |
| グルタラールデヒド | Fisher Scientific | G7776 | |
| グリシン | Research Organics | BP381-1 | |
| トリス | Sigma-Aldrich | 9682T | |
| アジ化ナトリウム | Amresco | 71289 | |
| ウシ血清アルブミン | Sigma-Aldrich | AMR-0332-100G | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| EDTA | マイクロサテライト不安定性 | E9884 | |
| ニトロセルロース | Sigma-Aldrich | 60443 | |
| N,N-ジメチルホルムアミド | Large Newから抽出 | D4254 | |
| ウサギ骨格筋ミオシンII | ニューゼランドホワイトウサギ（7-8匹） | 該当なし | |
| MF30抗体 (9-10) | Developmental Studies Hybridoma Bank | MF30 | |
| MF20抗体 (6) | ハイブリドーマバンク | MF20 | |
| 研究用顕微鏡 | 北方地域 | WW57905M00 | |
| 赤道儀 | Celestron | CG-5 | |
| デジタルビデオカメラ | ソニー株式会社 | XCDV60 | |
| キャリパーの取り外し | カベラス | IA-415482 | |
| 圧縮ばね | Jones Spring Co. | 723 | |
| 引張ばね | Jones Spring Co. | 770 | |
| ImageJ | アメリカ国立衛生研究所 | 該当事項なし | |
| Fire-iドライバー &増幅および応用 | ユニブレイン | 3.80 | |
| エクセル | Microsoft | 該当なし |
参考文献
- Schwaiger, I., Sattler, C., Hostetter, D. R., Rief, M. The myosin coiled-coil is a truly elastic protein structure. Nat. Mater. 1, 232-235 (2002).
- Root, D. D., Yadavalli, V. M., Forbes, J. G., Wang, K. Coiled-coil nanomechanics and uncoiling and unfoldin....
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再版と許可
