Analysera funktion Små GTPases genom mikroinjektion av plasmider till Polarized epitelceller
Summary
Den här artikeln detaljer förfarandet i samband överuttryck och analys av små GTPases i polariserade epitelceller med mikroinjektion teknik.
Abstract
Epitelceller polarisera sina plasmamembranet i biokemiskt och funktionellt olika apikala och basolateral domäner där apikala domän står det "fria" ytor och basolateral membranet är i kontakt med underlaget och angränsande celler. Båda membran domäner är åtskilda av tight junctions, som utgör en diffusionsspärr. Apikala-basolateral polarisering kan rekapituleras framgångsrikt i kultur när epitelceller som Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) celler är seedade i hög densitet på polykarbonat filter och odlade i flera dagar 1 2. Upprättande och underhåll av cellens polaritet regleras av en rad små GTPases av Ras superfamiljen som Rala, Cdc42, Rab8, Rab10 och Rab13 3 4 5 6 7. Liksom alla GTPases dessa proteiner växla mellan en inaktiv BNP-bundet tillstånd och ett aktivt GTP-bundet tillstånd. Specifika mutationer i nukleotid bindande regionerna störa denna cykel 8. Till exempel är Rab13T22N permanent låst i BNP-form och därför kallas "dominerande negativ", medan Rab13Q67L inte längre kan hydrolysera GTP och är därmed låst i ett "dominerande aktiva" status 7. Att analysera deras funktion i celler både dominerande negativa och dominerande aktiva alleler av GTPases normalt uttrycks på höga nivåer för att störa funktionen av kroppsegna proteiner 9. Ett elegant sätt att uppnå en hög nivå av överuttryck i en kort tid är att införa de plasmider som kodar för relevanta proteiner direkt i kärnan av polariserade celler som odlas på filtret stöder med mikroinjektion teknik. Detta kombineras ofta med samtidig injektion av reporter plasmider som kodar för receptorer plasmamembranet som är specifikt sorteras till apikala eller basolateral domän. En last som används ofta för att analysera last sortering till basolateral domänen är en temperaturkänslig varianten av vesikulär stomatit virus glykoprotein (VSVGts045) 10. Detta protein kan inte lägga sig ordentligt vid 39 ° C och blir därmed kvar i endoplasmatiska retiklet (ER), medan det föreskrivande proteinet av intresse är monterade i cytosolen. En övergång till 31 ° C att sedan låta VSVGts045 att lägga på rätt sätt, lämna ER och resa till plasmamembranet 11. Denna jakt är vanligtvis utförs i närvaro av cykloheximid för att förhindra ytterligare proteinsyntesen vilket leder till renare resultat. Här beskriver vi i detalj förfarandet för microinjecting plasmider till polariserade celler och efterföljande inkubationer inklusive temperatur förändringar som gör en omfattande analys av reglerande proteiner involverade i basolateral sortering.
Protocol
Discussion
Den mest kritiska stegen för en lyckad mikroinjektion experiment är kvalitet och renhet av DNA och polariteten av dina celler. Utan polariserade celler, kommer din injektion kontroll redan har mistargeted VSVG och experimentet kan inte användas. Om DNA är av dålig kvalitet, kan DNA täppa injektionsnålen som leder till dålig eller ingen uttryck av det önskade proteinet alls. Dessutom är det tillrådligt att använda uttrycket plasmider som är kända för att leda till höga uttryck nivåer som pRKV.
<p cla…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats av ett stipendium från National Institutes of Health (GM070736) till H. Fölsch. SF Ang stöddes av en A * STAR Graduate Stipendieutdelning, och RS Kang stöddes av den cellulära och molekylära grunden för sjukdom Training Program (GM8061)
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number |
| Axiovert 200 Microscope with heated stage | Carl Zeiss Inc | Custom order |
| Injectman NI2 Femtojet micromanipulator | Eppendorf | Custom order |
| Femtotips II (Microinjection needles) | Eppendorf | 930000043 |
| Microloader tips | Eppendorf | 930001007 |
| Clear 12-mm transwell filter supports | Corning Costar | 3460 |
| Endotoxin-free plasmid maxiprep kit | Sigma-Aldrich | NA0400 |
References
- Mellman, I., Nelson, W. J. . Nature reviews. 9 (11), 833-833 (2008).
- Rodriguez-Boulan, E., Kreitzer, G., Musch, A. . Nature reviews. 6 (3), 233-233 (2005).
- Ang, A. L., Fölsch, H., Koivisto, U. M. . The Journal of cell biology. 163 (2), 339-339 (2003).
- Kroschewski, R., Hall, A., Mellman, I. . Nature cell biology. 1 (1), 8-8 (1999).
- Moskalenko, S., Henry, D. O., Rosse, C. . Nature cell biology. 4 (1), 66-66 (2002).
- Schuck, S., Gerl, M. J., Ang, A. . Traffic (Copenhagen, Denmark). 8 (1), 47-47 (2007).
- Nokes, R. L., Fields, I. C., Collins, R. N. . The Journal of cell biology. 182 (5), 845-845 (2008).
- Collins, R. N. Molecular cell. 12, 1064-1064 (2003).
- Hall, A. . Science (New York, N.Y. 279 (5350), 509-509 (1998).
- Scales, S. J., Pepperkok, R., Kreis, T. E. . Cell. 90 (6), 1137-1137 (1997).
- Keller, P., Toomre, D., Diaz, E. . Nature cell biology. 3 (2), 140-140 (2001).
