Engineering Biologiska-Based Vascular Grafts Med en pulserande Bioreaktor
Summary
Vår grupp har utvecklat ett system bioreaktor kultur som efterliknar fysiologiska pulserande betonar av det kardiovaskulära systemet för att regenerera implanterbara liten diameter vaskulära ympkvistar.
Abstract
Mycket arbete har ägnats åt att utveckla och främja metoder för att återskapa funktionella liten diameter arteriella förbi. I den fysiologiska miljön är både mekanisk och kemisk stimulering krävs för att upprätthålla en god utveckling och funktion av arteriell fartyg 1,2.
Bioreaktor kultur system som utvecklats av vår grupp är avsedda att stödja fartyget förnyelse inom en exakt kontrollerad kemo-mekaniska miljön imiterar att inhemska fartyg. Vår bioreaktor montering och underhåll är ganska enkel och hög repeterbarhet 3,4. Glatta muskelceller (SMC) är seedade på en tubulär polyglycolic syra (PGA) nät som träs över kompatibel silikonslang och odlas i bioreaktor med eller utan pulserande stimulans i upp till 12 veckor. Det finns fyra huvudsakliga attribut som skiljer våra bioreaktor från några föregångare. 1) Till skillnad från andra kultur-system som simulerar bara den biokemiska omgivande inhemska blodkärl, skapar vår bioreaktor också ett fysiologiskt pulserande miljö genom att cykliska radiell belastning på fartyg i kulturen. 2) Flera tillverkade fartyg kan odlas samtidigt under olika mekaniska förhållanden i en kontrollerad kemisk miljö. 3) Den bioreaktor tillåter en mono lagret av endotelceller (EG) lätt kan appliceras på de luminala sidan av konstruerade fartyg för djurmodeller implantation. 4) Vår bioreaktor kan också kulturen konstruerad fartyg med olika diameter storlek varierade från 1 mm till 3 mm, vilket sparar arbetet med att skräddarsy varje enskild bioreaktor för att passa en viss diameter storlek.
De tekniska fartyg odlade i våra bioreaktor liknar infödda blodkärl histologiskt till viss del. Celler i kärlväggen uttrycka mogna SMC kontraktila markörer som glatt muskulatur myosin heavy chain (SMMHC) 3. En betydande del av kollagen deponeras inom det extracellulära matrix, som ansvarar för ultimat mekanisk hållfasthet konstruerad fartyg 5. Biokemiska analys indikerar också att kollagenhalten av konstruerade fartyg är jämförbar med infödda artärer 6. Viktigare är att pulserande bioreaktor regenererade konsekvent fartyg som uppvisar mekaniska egenskaper som medger lyckad implantation experiment i djurmodeller 3,7. Dessutom kan detta bioreaktor ändras ytterligare för att i realtid utvärdering och uppföljning av kollagen remodeling över tid, icke-invasivt, med hjälp av en icke-linjär optisk mikroskopi (NLOM) 8. Avslutningsvis bör detta bioreaktor fungera som en utmärkt plattform för att studera de grundläggande mekanismerna som reglerar förnyelse av funktionella liten diameter vaskulära ympkvistar.
Protocol
Discussion
Kvaliteten på konstruerade fartyg är till stor del styrs av kvaliteten på SMC används i vävnadskultur. Den kritiska aspekterna av SMC fenotyp inkluderar kontraktila morfologi, låg passage nummer, och förmågan att föröka sig inne i bioreaktor. Vi rekommenderar att passagen antalet inte vara större än P3 vid cellens kärna ur på polymeren schavotten. Dessutom är det viktigt att bekräfta att SMC källorna är mykoplasma fria före användning. Vi har observerat att mykoplasma-smittade celler leda till betyda…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete finansieras av National Institutes of Health Grant R01 EB-008.836 och R01 HL083895 (både LEN). Vi kan tacka Daryl Smith, University Glasblåsarmästare, för att göra bioreaktorer för vår forskning.
Materials
| Name of Reagent/Material | Supplier | Catalogue Number |
|---|---|---|
| FBS (Fetal Bovine Serum) Heat-Inactivated | HyClone | SH30071 |
| DMEM | GIBCO | 11885 |
| rhFGF-basic | R&B | 234-FSE |
| rrPDGF-BB | R&B | 520-BB |
| Penicilin G | Sigma | PENNA |
| Copper(II) Sulfate | Sigma | C8027 |
| Gylcine | Sigma | C8790 |
| L-Alanine | Sigma | A7469-25G |
| L-Proline | Sigma | P5607-25G |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4544-25G |
| HEPES | Sigma | H3375-100G |
| Silicone Stopper | Cole-Parmer | 06298-24 |
| Masterflex tubes L/S | Cole-Parmer | 06508-16, 06508-18 |
| Masterflex pump | Cole-Parmer | 7553-80 |
| Dacron cuff | Maquet | 174406 |
| PGA felt | Concordia | MO000877-01 |
| 4-0 1.5 metric Surgipro II suture | Syneture | VP-557-X |
| 6-0 0.7 metric Dexon suture | Syneture | 7538-11 |
| 0.22μm PTFE filters | Whatman | 6780-2502 |
| Three Way Stop-cock | Edwards Lifesciences | 593WSC |
| Pressure Transducer | Edwards Lifesciences | PX212 |
| IV bags | Baxter | R4R2110 |
| Saline dilution set | Arrow | W20030 |
| Silicone tubing | Saint-Gobain | F05027 |
References
- Risau, W., Flamme, I. Vasculogenesis. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 73-91 (1995).
- Fankhauser, F., Bebie, H., Kwasniewska, S. The Influcence of mechanical Forices and Flow Mechanisms on Vessel Occlusion. Lasers in Surgery and Medicine. 6, 530-532 (1987).
- Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R. Functional arteries grown in vitro. Science. 284, 489-493 (1999).
- Prabhakar, V., Grinstaff, M. W., Alarcon, J., Knors, C., Solan, A. K., Niklason, L. E. Engineering porcine arteries: Effects of scaffold modification. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67A, 303-311 (2003).
- Mitchell, S. L., Niklason, L. E. Requirements for growing tissue-engineered vascular grafts. Cardiovascular Pathology. 12, 59-64 (2003).
- Dahl, S. L. M., Rhim, C., Song, Y. C., Niklason, L. E. Mechanical properties and compositions of tissue engineered and native arteries. Annals of Biomedical Engineering. 35, 348-355 (2007).
- Quint, C., Kondo, Y., Manson, R. J., Lawson, J. H., Dardik, A., Niklason, L. E. Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9214-9219 (2011).
- Niklason, L. E., Yeh, A. T., Calle, E. A., Bai, Y., Valentín, A., Humphrey, J. D. Enabling Tools for Engineering Collagenous Tissues Integrating Bioreactors, Intravital Imaging, and Biomechanical Modeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 3335-3339 (2010).
- Gong, Z., Calkins, G., Cheng, E. -. c., Krause, D., Niklason, L. E. Influence of Culture Medium on Smooth Muscle Cell Differentiation from Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells. Tissue Engineering Part A. 15, 319-330 (2009).
- Gong, Z. D., Niklason, L. E. Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs. Faseb Journal. 22, 1635-1648 (2008).
- Poh, M. Blood vessels engineered from human cells. Lancet. 365, 2122-2124 (2005).
- American Heart Association. . Biostatistical fact sheet: cardiovascular procedures. , (2002).
