Vi visar, hur man använder 2-foton mikroskopi för observation av dynamiken i neutrofila granulocyter i infekterade lungor medan de phagocytose patogener eller producera neutrofil extracellulärt fällor (NET).
Efter mag-tarmkanalen, är lungan den näst största ytan för samverkan mellan ryggradsdjur kroppen och miljön. Här måste en effektiv gasväxling upprätthållas, samtidigt som man undviker infektion av olika patogener som andas in under normal andning. För att uppnå detta finns en fantastisk uppsättning av försvarsstrategier kombinera humorala och cellulära immunförsvaret mekanismer. En av de mest effektiva åtgärderna för akut försvar av lungan är rekryteringen av neutrofiler, som antingen phagocytose den inandade patogener eller döda dem genom att släppa cytotoxiska kemikalier. Ett nytt tillägg till den arsenal av neutrofiler är deras explosiva utsläpp av extracellulärt DNA-NET med vilka bakterier eller svamp kan smitta eller inaktiverat även efter NET släppa cellerna har dött. Vi presenterar här en metod som tillåter en att direkt observera neutrofiler, migrering inom en nyligen smittad lunga, phagocytosing svamppatogener samt visualisera den omfattande nät som de har producerat under hela den infekterade vävnaden. Metoden beskriver beredningen av tjocka livskraftiga lunga skivor 7 timmar efter intratrakeal infektion av möss med conidia av formen Aspergillus fumigatus och deras granskning av multicolor tidsförlopp 2-foton mikroskopi. Detta tillvägagångssätt gör att man direkt undersöka svampdödande försvar i modersmål lungvävnad och därmed öppnar en ny väg för detaljerad utredning av pulmonell immunitet.
Real-time 2-foton mikroskopi in vivo eller in intakta organ har fått djupgående betydelse i studier som handlar om fysiologi av immunceller under de senaste 10 åren. Det var med denna teknik att viktiga händelser som dynamiken i T-cells aktivering inom lymfkörtlarna först blev synliga 2-4. På senare tid har forskarna också börjat analysera specifika cellulära funktioner som de första stegen i skapandet av effektor celler i lymfatiska vävnader med hjälp av denna metod 5.
Men trots ett antal nya biologiska koncept har visat med den här metoden finns det fortfarande utmanande och viktiga frågor för vilka det inte intravital visualisering undersökningar har publicerats hittills. Framför allt gäller detta de däggdjur lungan. Den intressanta aspekten av detta organ, som inresa port för en mängd olika luftburna patogener, gör den till en av de mest avgörande ytor där immunologiska processer äger rum i däggdjurens kropp. Med varje andetag hela livslängd, är oönskade partiklar andas in en del som har potential att inducera livshotande infektioner 6. Det är självklart att vid en sådan känslig och hotade platsen ett tätt nätverk av försvarsmekanismer behöver vara närvarande uppvisar hela repertoaren av immunsvaret. Å andra sidan är det mycket viktigt att immunologiska kampen mot potentiella patogener på en sådan "smutsig" plats är hårt kontrollerad. Överdrivna reaktioner av immunförsvaret bära en hög risk för att skada den egna kroppen genom massivt skadades organvävnad vid stimulering av ospecifika immunceller åtgärder 7,8.
Mot bakgrund av dessa tankar skulle det vara mycket intressant och bra att ha möjlighet att undersöka cellens beteende hos däggdjur lungorna i sann in vivo-förhållanden. Det faktum att ett sådant system har hittills inte lyckats genomförts tydligt pekar på de enorma svårigheter som måste lösas i inrättandet av en arbetsgrupp protokoll. Den mest krävande utmaning är nog fokus stabilitet. Lungan som organ som ansvarar för andningen är under ständig rörelse i alla tre riktningar i rymden för att förverkliga inandning. Denna omständighet ensam orsakar svår avbildning problem och kan betraktas som en intravital värmekameror "mardröm". Redan en liten rörelse till en dimension i rymden har en massiv negativ inverkan på mikroskopiska uppfattning, som måste vara stabil med mikrometer precision för att generera meningsfulla bilder 9. Med tanke på dess inneboende snäva lokalt fokus 10, 2-foton mikroskopi är ännu mer känslig för fokal instabiliteter, som en förskjutning av en viss struktur i storleksordningen några mikrometer i Z-riktning motsvarar en total förlust av fokus och därmed ett misslyckat experiment.
Protokollet som presenteras i denna studie för observation av immunceller i murina lungorna är fortfarande inte en in vivo ansökan, utan snarare en noggrann uppskattning av situationen i ett funktionellt intakta lunga 11. Ex vivo-metoder för avbildning lymfocyter, t.ex. i explanterade lymfan knutpunkter, har visat sig ge resultat som motsvarar verkliga in vivo-observationer 12 och därmed är högst relevanta 5. In situ observationer i lungorna skivor, som är bara möjligt med vår strategi, att äga rum i en smittad lunga strax efter excision. 3D-integritet under skärprocessen säkerställs genom agaros matris, ett viktigt steg för att möjliggöra en exakt kontrollerad skärprocess av lungan. Även om det är nödvändigt att kyla explanterade lungan under en kort period för att möjliggöra en stelning av agaros matrisen är det möjligt att återgå till nära fysiologiska förhållanden för celler efter styckning rewarming av vävnaden. Detta framgår tydligt av våra data, vilket visar att under dessa förhållanden neutrofiler är mycket aktiva och uppvisar sin fulla potential som smidig fagocyter, som är nödvändiga för en effektiv clearance av en Aspergillus fumigatus infektion. De patrullerar lungorna passerar genom epiteliala hinder för att nå de inre delarna av alveolerna och vidare de aktivt tar upp svampsporer 11. En viktig slutsats av detta arbete var förekomsten av strukturer som liknar neutrofila extracellulärt fällor (NET) i Aspergillus-infekterade orgel. NET är en mycket nyligen upptäckt en ny försvarsmekanism i neutrofiler 13. Men sedan dess inledande redogörelse 2004, har antalet fysiologiska eller patologiska tillstånd i djurmodeller och människor där detta fenomen har observerats eller saknas varit explosionsartat ökat 14-16. Intressant, men så mycket arbete har lagts ner på dessa strukturer av så många olika grupper, de flesta rapporter är fortfarande på en mycket beskrivande nivå och inte mycket ärkänt om den mekanism NET utsläpp och dess reglering. Med våra protokoll kunde vi för första gången att visa NET fibrer i en smittad lunga. Dessutom kunde vi visa vikten av nyligen rekryterade neutrofiler samt molekylära svamp strukturer för deras förekomst eller hämning 11. Detta visar tydligt potentialen i vår metod att undersöka enda steg NET bildas mer i detalj. Man kan tänka till exempel att använda neutrofila granulocyter från lämplig knock-out möss att observera deras förmåga NET bildas i adoptiv transfer experiment.
Även om den direkta observationen av neutrofila invandring från perifert blod är inte möjligt med detta system på grund av bristande blodtillförsel efter orgel borttagning, tror vi fortfarande att våra protokoll är ett värdefullt och relativt lätt att hantera tillvägagångssätt som gör det möjligt att avbilda tidigt eller sent steg i immunförsvaret mot infektioner i lungorna. Detta är därför ett viktigt steg mot att undersöka detta fenomen inom andas lunga av levande djur.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Dr Lars Philipsen för hjälp med att optimera intravital filmer, Dr Jonathan Lindquist för att noggrant ha läst manuskriptet, och alla medlemmar i Gunzer laboratorium för bra diskussioner och synpunkter under utvecklingen av metoden. Detta arbete har finansierats av bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, SFB 854) till MG