Высокая чувствительность 5-hydroxymethylcytosine Обнаружение в Balb / C ткани мозга

Summary

EpiMark 5-HMC и 5-тС Анализ Kit может быть использован для анализа и количественного 5-метилцитозин и 5-hydroxymethylcytosine в специально cific локуса. Комплект отличается 5-тС из 5-HMC добавлением глюкозы в гидроксильные группы 5-HMC через ферментативной реакции использованием β-glucosyltransferase (Т4-BGT). Когда 5-HMC происходит в контексте КСДУ, эта модификация превращает расщепляемого сайт MspI к не-расщепляемого сайта.

Abstract

DNA hydroxymethylation is a long known modification of DNA, but has recently become a focus in epigenetic research. Mammalian DNA is enzymatically modified at the 5^th carbon position of cytosine (C) residues to 5-mC, predominately in the context of CpG dinucleotides. 5-mC is amenable to enzymatic oxidation to 5-hmC by the Tet family of enzymes, which are believed to be involved in development and disease. Currently, the biological role of 5-hmC is not fully understood, but is generating a lot of interest due to its potential as a biomarker. This is due to several groundbreaking studies identifying 5-hydroxymethylcytosine in mouse embryonic stem (ES) and neuronal cells.

Research techniques, including bisulfite sequencing methods, are unable to easily distinguish between 5-mC and 5-hmC . A few protocols exist that can measure global amounts of 5-hydroxymethylcytosine in the genome, including liquid chromatography coupled with mass spectrometry analysis or thin layer chromatography of single nucleosides digested from genomic DNA. Antibodies that target 5-hydroxymethylcytosine also exist, which can be used for dot blot analysis, immunofluorescence, or precipitation of hydroxymethylated DNA, but these antibodies do not have single base resolution.In addition, resolution depends on the size of the immunoprecipitated DNA and for microarray experiments, depends on probe design. Since it is unknown exactly where 5-hydroxymethylcytosine exists in the genome or its role in epigenetic regulation, new techniques are required that can identify locus specific hydroxymethylation. The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit provides a solution for distinguishing between these two modifications at specific loci.

The EpiMark 5-hmC and 5-mC Analysis Kit is a simple and robust method for the identification and quantitation of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine within a specific DNA locus. This enzymatic approach utilizes the differential methylation sensitivity of the isoschizomers MspI and HpaII in a simple 3-step protocol.

Genomic DNA of interest is treated with T4-BGT, adding a glucose moeity to 5-hydroxymethylcytosine. This reaction is sequence-independent, therefore all 5-hmC will be glucosylated; unmodified or 5-mC containing DNA will not be affected.

This glucosylation is then followed by restriction endonuclease digestion. MspI and HpaII recognize the same sequence (CCGG) but are sensitive to different methylation states. HpaII cleaves only a completely unmodified site: any modification (5-mC, 5-hmC or 5-ghmC) at either cytosine blocks cleavage. MspI recognizes and cleaves 5-mC and 5-hmC, but not 5-ghmC.

The third part of the protocol is interrogation of the locus by PCR. As little as 20 ng of input DNA can be used. Amplification of the experimental (glucosylated and digested) and control (mock glucosylated and digested) target DNA with primers flanking a CCGG site of interest (100-200 bp) is performed. If the CpG site contains 5-hydroxymethylcytosine, a band is detected after glucosylation and digestion, but not in the non-glucosylated control reaction. Real time PCR will give an approximation of how much hydroxymethylcytosine is in this particular site.

In this experiment, we will analyze the 5-hydroxymethylcytosine amount in a mouse Babl/C brain sample by end point PCR.

Protocol

1. Glucosylation ДНК и контроля реакции В 1,5 мл реакционной трубы на лед, перемешать 5-10 мкг геномной ДНК (для конечной концентрации 30 мкг / мл), 12,4 мкл UDP-глюкозы (для конечной концентрации 80 мкмоль), 31 мкл NEBuffer 4 и до 310 мкл нуклеазы без воды довести общий объем до 310 мкл. Сплит этой реакционной смеси на две трубы из 155 мкл каждого из них. Затем добавить 30 единиц, или 3 мкл, Т4-β-glucosyltransferase к одной трубке. Хорошо перемешайте, аккуратно пипетирования вверх и вниз. Вторая трубка контрольной реакции, так что добавьте 3 мкл воды, вместо того, Т4-BGT. Инкубируйте обе трубки на 37 градусов по Цельсию в течение 12 до 18 часов, в течение которых Т4-BGT добавят глюкозы гидроксильные группы 5-hydroxymethylcytosine групп в образце. 2. Пищеварение рестрикции Этикетка три 0,2 мл ПЦР-полосы трубы цифры от 1 до 3. Алиготе 50 мкл реакционной смеси в каждую. Этикетка три 0,2 мл ПЦР-полосы трубы номера с 4 по 6. Алиготе 50 мкл контроля смесь в каждом. Добавить 100 единиц, или на 1 мкл, из MspI в пробирки 1 и 4. Хорошо перемешайте, аккуратно пипетирования вверх и вниз. Добавить 50 единиц, или на 1 мкл, из HpaII в пробирки, 2 и 5. Хорошо перемешайте, аккуратно пипетирования вверх и вниз. Не добавляйте ничего, чтобы трубы 3 и 6, так как они являются элементами управления. Инкубируйте всех 6 труб при температуре 37 градусов по Цельсию в течение не менее 4 часов. Добавить 1 мкл протеиназы К в каждую пробирку и инкубировать при температуре 40 градусов по Цельсию в течение 30 минут. Инактивировать протеиназы К путем инкубации при температуре 95 градусов по Цельсию в течение 10 минут. 3. Анализ ДНК методом ПЦР / КПЦР Этот протокол использует NEB в LongAmp Taq для конечной точки ПЦР, который был проявлен к хорошей работе. Другие протоколы ПЦР могут быть заменены. Добавьте следующие компоненты в 0,2 мл ПЦР-реакции пробирку на льду: 10 мкл 5X LongAmp Taq реакционного буфера, 1,5 мкл 10 мМ дНТФ, 1 мкл 10 мкмоль прямого праймера, 1 мкл 10 мкмоль Primer назад, 3 мкл шаблон ДНК из предыдущих шагов, 1 микролитр LongAmp ДНК-полимеразы Taq и нуклеазы без воды до 50 мкл. Эти объемы могут меняться в зависимости от используемого протокола ПЦР. Аккуратно перемешайте реакции. При необходимости собрать все жидкости в нижней части трубы быстро вращаться. Наложение образца с минеральным маслом при использовании амплификаторе без подогревом крышкой. Передача пробирки для ПЦР изо льда в Термоциклер с блока предварительно нагретую до 94 градусов по Цельсию и начать езда на велосипеде программы. Для рутинной 3-х ступенчатый ПЦР, должен быть один первый шаг денатурации при 94 градусах Цельсия в течение 30 секунд, затем 30 циклов 94 градусов Цельсия денатурации в течение 15 секунд, от 55 до 65 градусов Цельсия отжига в течение 30 секунд, и 65 градусов по Цельсию расширение в течение 20 секунд, или 50 секунд кб. Это должно сопровождаться одним последним продлением на 65 градусов по Цельсию в течение 5 минут. ПЦР в реальном времени также может быть выполнена для количественного определения количества 5-метилцитозин и 5-hydroxymethylcytosine. Пожалуйста, ознакомьтесь с руководством по продукции, найденный на neb.com конкретной информации. 4. Представитель Результаты: Рисунок 1. Сравнение 5-hydroxymethylcytosine суммы в локусе 12 в другую мышь Balb / C образцы тканей. (А), конечного точки ПЦР. (B), ПЦР в реальном времени. ДНК из четырех тканях мышей были проанализированы. Для сравнения, ПЦР в реальном времени данные были нормированы на режиссерский ДНК. Стандартная кривая была использована для определения количества копий. Образцы могут быть нормализованы путем деления количества копий образцов не по 1-6 числа копий управления, непереваренные (№ 5). Штучной упаковке полосы геля показано изменение в 5-HMC настоящее время.

Discussion

Есть несколько важных вещей, чтобы рассмотреть при создании этого эксперимента. Во-первых, важно, чтобы glucosylation геномной ДНК переходит к завершению. Последовательность Специфичность Т4-BGT не известно, и это, кажется, нет другого выбора, для подложки последовательности. Поэтому в некоторых случаях более длительное время инкубации может быть необходимым. Во-вторых, MspI и HpaII пищеварения должна быть полной, чтобы избежать фонового сигнала. Для этих ферментов рестрикции, мы рекомендуем инкубации в течение 4 часов, но больше инкубации могут быть выполнены при неполном расщеплении наблюдается. В-третьих, количество входных ДНК может быть скорректирован в зависимости от доступности, с 20 NGS ДНК может быть использована для конечной точки ПЦР. Наконец, мы рекомендуем использовать поставляемые контроль ДНК, которые могут работать параллельно с геномной ДНК в течение 5-MC и 5-HMC количественной оценке.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit		New England Biolabs	E3317
Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest				Custom per experiment; provided by user
LongAmp® Taq DNA Polymerase		New England Biolabs	M0323
dNTPs		New England Biolabs	N0447
molecular biology grade water