Termodinamica di Folding delle proteine di membrana Misurato in spettroscopia di fluorescenza
Summary
Questo articolo dettagli video la procedura sperimentale per ottenere l'energia libera di Gibbs di ripiegamento delle proteine della membrana da triptofano fluorescenza.
Abstract
Ripiegamento delle proteine della membrana è un tema emergente di significati fondamentali e relativi alla salute. L'abbondanza di proteine di membrana delle cellule in base alla necessità per lo studio completo della piegatura di questa famiglia ubiquitaria di proteine. Inoltre, i progressi nella capacità di caratterizzare malattie associate con le proteine mal ripiegate hanno motivato notevoli sforzi teorici e sperimentali nel campo del ripiegamento delle proteine. Rapidi progressi in questo importante settore è purtroppo ostacolata dalle sfide inerenti associate proteine di membrana e la complessità del meccanismo di ripiegamento. Qui, delineare una procedura sperimentale per la misura di proprietà termodinamiche di energia libera di Gibbs di dispiegarsi in assenza di denaturante, Δ G ° H 2 O, per una proteina di membrana integrale rappresentante da E. coli. Questo protocollo si concentra sull'applicazione della spettroscopia di fluorescenza per determinare l'equilibrio le popolazioni degli stati piegato e spiegato in funzione della concentrazione di denaturante. Considerazioni sperimentali per la preparazione di vescicole lipidiche sintetici, nonché alle fasi principali della procedura di analisi dei dati sono evidenziati. Questa tecnica è versatile e può essere perseguito con diversi tipi di denaturante, tra cui la temperatura e pH, così come in vari ambienti ripiegamento dei lipidi e delle micelle. Il protocollo attuale è quella che può essere generalizzato a qualsiasi membrana o proteina solubile che soddisfa l'insieme dei criteri discussi di seguito.
Protocol
Discussion
L'attuale protocollo descrive la generazione di curve di svolgimento associata alla membrana proteine e peptidi che contengono residui di triptofano. Qui, si presume che la fluorescenza triptofano riflette se la proteina viene piegato e inserito in vescicole lipidiche sintetico, o si è svolto in soluzione. Ipotesi aggiuntive, come due Stati piegatura e dipendenza lineare di energia libera con concentrazione denaturante, sono contenute nella relazione corrente;. Modifica di tali presupposti risultato in divers…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Wu Pechino per l'utilizzo dei suoi dati. Questo lavoro è stato supportato da un riconoscimento alla CARRIERA NSF a JEK
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMPC | Avanti Polar Lipids | 850345C | ||
| Urea | MP Biochemicals | 04821527 | ||
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher | P288 | ||
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher | P285 |
References
- Shirley, B. A., Shirley, B. A. . Protein Folding and Stability. , 177-190 (1995).
- Pace, C. N. Determination and Analysis of Urea and Guanidine Hydrochloride Denaturation Curves. Methods Enzymol. 131, 266-279 (1986).
- Lau, F. W., Bowie, J. U. A Method for Assessing the Stability of a Membrane Protein. Biochemistry. 36, 5884-5892 (1997).
- Burgess, N. K., Dao, T. P., Stanley, A. M., Fleming, K. G. β-Barrel Proteins that Reside in the Escherichia coli Outer Membrane in Vivo Demonstrate Varied Folding Behavior in Vitro. J. Biol. Chem. 283, 26748-26758 (2008).
- Booth, P. J., Curnow, P. Folding scene investigation: membrane proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 19, 8-13 (2009).
- Hong, H., Tamm, L. K. Elastic coupling of integral membrane protein stability to lipid bilayer forces. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 4065-4070 (2004).
- Sanchez, K. M., Gable, J. E., Schlamadinger, D. E., Kim, J. E. Effects of Tryptophan Microenvironment, Soluble Domain, and Vesicle Size on the Thermodynamics of Membrane Protein Folding: Lessons from the Transmembrane Protein OmpA. Biochemistry. 47, 12844-12852 (2008).
