Thermodynamik der Membrane Protein Folding durch Fluoreszenz-Spektroskopie
Summary
Dieses Video Artikel beschreibt die experimentellen Verfahren zur Erlangung der Gibbs-Membran Proteinfaltung durch Tryptophan-Fluoreszenz.
Abstract
Membrane Proteinfaltung ist ein aufstrebendes Thema sowohl mit Grundlagen-und gesundheitsbezogene Bedeutung. Die Fülle von Membranproteinen in der Zelle zugrunde liegt die Notwendigkeit einer umfassenden Studie über die Faltung von dieser allgegenwärtigen Familie von Proteinen. Darüber hinaus haben Fortschritte in unserer Fähigkeit, Krankheiten, die mit falsch gefalteten Proteinen assoziiert kennzeichnen signifikante experimentelle und theoretische Anstrengungen auf dem Gebiet der Proteinfaltung motiviert. Schnelle Fortschritte in diesem wichtigen Bereich ist leider durch die inhärenten Herausforderungen mit Membranproteinen und der Komplexität der Klappmechanismus verbunden behindert. Hier skizzieren wir ein experimentelles Verfahren zur Messung der thermodynamischen Eigenschaft der Gibbs-Energie der Entfaltung in Abwesenheit von Denaturierungsmittel, Δ G ° H 2 O, für eine repräsentative integrales Membranprotein von E. coli. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Anwendung der Fluoreszenz-Spektroskopie, um das Gleichgewicht Populationen von gefalteten und ungefalteten Zuständen als Funktion der Denaturierungsmittel Konzentration zu bestimmen. Experimentelle Überlegungen für die Herstellung von synthetischen Lipidvesikeln sowie wichtige Schritte in der Datenanalyse Verfahren sind hervorgehoben. Diese Technik ist vielseitig und kann mit verschiedenen Arten von Denaturierungsmittel, einschließlich Temperatur und pH-Wert, sowie in verschiedenen Umgebungen Faltung von Lipiden und Mizellen verfolgt werden. Das aktuelle Protokoll ist eine, die verallgemeinert werden, um eine Membran oder lösliches Protein, das die Kriterien erfüllt, kann unten besprochen.
Protocol
Discussion
Das aktuelle Protokoll beschreibt die Generation der Entfaltung Kurven von Membran-assoziierte Proteine und Peptide, die Tryptophan enthalten. Hier wird davon ausgegangen, dass die Tryptophan-Fluoreszenz spiegelt, ob das Protein gefaltet ist und eingefügt in synthetische Lipidvesikel oder entfaltet in Lösung. Zusätzliche Annahmen, wie zB Zwei-Staaten-Faltung und lineare Abhängigkeit der freien Energie mit Denaturierungsmittel Konzentration, sind in dem aktuellen Bericht gemacht;. Modifikation von diesen Annahm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Peking Wu für die Verwendung ihrer Daten. Diese Arbeit wurde durch einen NSF CAREER Award an JEK unterstützt
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMPC | Avanti Polar Lipids | 850345C | ||
| Urea | MP Biochemicals | 04821527 | ||
| Potassium Phosphate Dibasic | Fisher | P288 | ||
| Potassium Phosphate Monobasic | Fisher | P285 |
References
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