Génération de cellules souches neurales à partir de tissus humains mis au rebut corticale fœtale

Résumé

Une méthode simple et fiable sur l'isolement et la culture des cellules souches neurales à partir des tissus humains jetés corticale du foetus est décrite. Cultures dérivées de humain connu des troubles neurologiques peuvent être utilisés pour la caractérisation des processus cellulaires et pathologiques moléculaires, ainsi que de fournir une plateforme pour évaluer l'efficacité pharmacologique.

Résumé

Les cellules souches neurales (NSC) résident le long de la zone ventriculaire neuroépithélium lors du développement de la plaque corticale. Ces premiers ancêtres de finalement donner naissance à des progéniteurs intermédiaires et plus tard, les divers sous-types de cellules neuronales et gliales qui forment le cortex cérébral. La capacité de générer et de développer NSCs humaine (ce qu'on appelle neurosphères) de tissus fœtaux jetés normale fournit un moyen avec lequel étudier directement les aspects fonctionnels de la normale du développement humain NSC ^1-5. Cette approche peut également être dirigée vers la génération de NSC à partir connu des troubles neurologiques, procurant ainsi l'occasion d'identifier les processus pathologiques qui altèrent la prolifération progénitrices, la migration et la différenciation ^6-9. Nous nous sommes concentrés sur l'identification des mécanismes pathologiques chez l'homme NSCs syndrome de Down qui pourraient contribuer à l'accélération de phénotype de la maladie d'Alzheimer ^10,11. Ni in vivo, ni dans les modèles murins in vitro peut reproduire le répertoire de gènes identiques situés sur le chromosome 21 humain.

Ici, nous utilisons une méthode simple et fiable pour isoler le syndrome de Down NSCs d'humains avortés cortex fœtal et les faire grandir dans la culture. La méthodologie fournit des aspects spécifiques de la récolte des tissus, la dissection des repères anatomiques limitées, tri cellulaire, de placage et repiquage du CNS humaine. Nous fournissons également des protocoles de base pour induire la différenciation des NSCs humains en sous-types de cellules plus sélective.

Protocole

1. Préparation des solutions et matériaux pour la dissection et l'entretien de la culture de cellules souches neurales

1. Préparer 100ml moyennes dissection (KNOCKOUT DMEM/F12, Invitogen) à l'avance et réfrigérer.
2. Prepare100 milieu de culture ml (Stem Pro NSC GDF, Invitrogen) et conserver à 37 ° C dans un bain d'eau.
3. Préparer la cellule de congélation moyenne (10% KNOCKOUT DMEM/F12 FBS + 5% DMSO) pour la cryoconservation des cellules à long terme.
4. Si désiré, préparer paraformaldéhyde à 4% (PFA) pour la fixation des tissus.
5. Stérile, pinces et les lames de bistouri autoclave avec des poignées sont utilisés pour la dissect....

Discussion

Il existe différentes approches envers les tissus de culture frais et la production de lignées cellulaires humaines. Historiquement, les tissus frais a été récolté et mis en culture immédiatement pour générer divers types de cellules dans le système nerveux central. Cette approche est toutefois clairement limité par le nombre d'échantillons qui peuvent être obtenus, qui dans le cas des échantillons humains, est généralement assez faible. Étant donné le degré minimal de la manipulation, fraîchement cultures de cellul.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
KNOCKOUT DMEM/F12	Invitrogen	12660-012	Milieu de dissociation
Tige Pro NSC GDF	Invitrogen	A10509-01	Le milieu de culture
Sérum de veau fœtal	Invitrogen	10091-148	Moyennes congelés
Hanks solution (-Ca 2 +,-Mg 2 +)	Invitrogen	14175-095	Milieu de dissociation
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650	Moyennes congelés
EDTA	Sigma-Aldrich	431788	Milieu de dissociation
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	158127	Solution de fixation
bFGF	R & D	234-FSE	Milieu de différenciation
SHH	R & D	1845-SH	Milieu de différenciation
PDGF-AA	R & D	221-AA	Milieu de différenciation
B27	Invitrogen	17504-044	Milieu de différenciation
De souris anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M2320	1:200
Lapin anti-DCX	Signalisation cellulaire	4604s	1:200
Lapin anti-GFAP	DAKO	Z0334	1:200
Lapin anti-S100B	DAKO	Z0311	1:200
Lapin anti-O1	dons de professeur Timothy Vartanian *		01:50
Lapin anti-O4	Cadeaux du professeur Timothy Vartanian *		01:50
Tamis cellulaire 40μm	BD Falcon	352340

* Timothy Vartanian, MD, Ph.D., Département de neurologie et de neuroscience, Weill Cornell Medical College, New York, USA