Простой и надежный метод изоляции и культуры нервных стволовых клеток из выброшенных человеческого плода корковой ткани описано. Культуры, полученные из известных человеческих неврологические расстройства могут быть использованы для характеристики патологических клеточных и молекулярных процессов, а также обеспечит платформу для оценки фармакологической эффективности.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Генерация нервные стволовые клетки из эмбриона человека Выкинуть корковой ткани
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Нервные стволовые клетки (NSCs) проживают вместе нейроэпителия зоны желудочков во время развития кортикальной пластинки. Эти ранние предшественники в конечном счете привести к промежуточной прародителей и позже, различных нервных и глиальных клеток подтипов, которые образуют кору головного мозга. Способность генерировать и расширить человеческие NSCs (так называемые нейросферы) из выброшенных нормальной эмбриональной ткани обеспечивает средства, с которыми непосредственно изучать функциональные аспекты нормального человеческого развития НСК 1-5. Этот подход может также быть направлена на генерацию NSCs от известных неврологических расстройств, тем самым предоставив возможность определить болезненные процессы, которые изменяют предшественников пролиферации, миграции и дифференциации 6-9. Мы сосредоточились на выявлении патологических механизмов в человеческом Вниз NSCs синдром, который может способствовать болезни фенотип ускоренного Альцгеймера 10,11. Ни в естественных условиях, ни в лабораторных мышах может повторить идентичных репертуар генов, расположенных на хромосомы человека 21.
Здесь мы используем простой и надежный способ, чтобы изолировать синдромом Дауна NSCs из абортированных человеческих эмбриональных коры и вырастить их в культуру. Методология предусматривает конкретные аспекты уборки ткани, рассечение с ограниченными ориентиры анатомические, сортировки клеток, покрытий и пассажи человека NSCs. Мы также предоставляем некоторые основные протоколы для индукции дифференциации человеческого NSCs в более избирательным подтипа клетки.
Протокол
1. Приготовление растворов и материалов для вскрытия и поддержание культуры нейронных стволовых клеток
- Подготовка 100мл рассечение среды (KNOCKOUT DMEM/F12, Invitogen) заранее и поставить в холодильник.
- Prepare100 мл культуральной среды (Stem Pro НСК SFM, Invitrogen) и хранить при температуре 37 ° С на водяной бане.
- Подготовка клеточного замораживания среды (KNOCKOUT DMEM/F12 +10% FBS + 5% ДМСО) на длительный срок криоконсервации клеток.
- При необходимости, подготовить 4% параформальдегида (PFA) для фиксации ткани.
- Стерильные, автоклавного щипцы и скальпель лезвиями с ручками используются для вскрытия.
- Устан....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Существуют различные подходы к культуре свежей ткани и производство человеческих клеточных линий. Исторически сложилось так, свежей ткани были собраны и культурным сразу генерировать различные типы клеток в центральной нервной системе. Этот подход, однако, четко ограничено количество образцов, которые могут быть получены, который в случае человеческих образцов, как правило, довольно мала. Учитывая минимальную степень манипуляции, только культурный нервные клетки обеспечивают наиболее надежные экспериментальные системы, .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа была выполнена при частичной поддержке Национального института здоровья: HD054347 и NS063997-01 к VLS. Эта работа также была частично поддержана Стволовые Эмпайр-Стейт-Сотовый фонд через Нью-Йорк Департамент здравоохранения штата Договор № C024324 для VLS. Мнения, высказанные здесь, являются исключительно автору и не обязательно отражают точку зрения Стволовые Эмпайр-Стейт-Сотовый совета штата Нью-Йорк Департамент здравоохранения, и штата Нью-Йорк. VLS является Дорис Дьюк Клинические Ученый развитием получателя премии. Мы также благодарим профессора Тимоти Вартанян за его дар Anti-O1, Анти-O4 антител.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Название реагента | Компания | Номер в каталоге | Комментарии (необязательно) |
| KNOCKOUT DMEM/F12 | Invitrogen | 12660-012 | Диссоциация среда |
| Стволовые Pro НСК SFM | Invitrogen | A10509-01 | Культура среда |
| Эмбриональной телячьей сыворотки | Invitrogen | 10091-148 | Замороженные среда |
| Хэнкс решение (-Ca 2 +,-Mg 2 +) | Invitrogen | 14175-095 | Диссоциация среда |
| ДМСО | Sigma-Aldrich | D2650 | Замороженные среда |
| ЭДТА | Sigma-Aldrich | 431788 | Диссоциация среда |
| Параформальдегид | Sigma-Aldrich | 158127 | Фиксация решение |
| bFGF | R & D | 234-FSE | Дифференциация среда |
| SHH | R & D | 1845-SH | Дифференциация среда |
| PDGF-AA | R & D | 221-AA | Дифференциация среда |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | Дифференциация среда |
| Мышь Anti-MAP2 | Sigma-Aldrich | M2320 | 1:200 |
| Кролик Anti-DCX | Сотовые сигнализации | 4604s | 1:200 |
| Кролик Anti-GFAP | DAKO | Z0334 | 1:200 |
| Кролик Anti-S100B | DAKO | Z0311 | 1:200 |
| Кролик Anti-O1 | подарки профессора Тимоти Вартанян * | 1:50 | |
| Кролик Anti-O4 | Подарки профессора Тимоти Вартанян * | 1:50 | |
| 40 мкм ячейки фильтра | BD Сокол | 352340 |
* Тимоти Вартанян, доктор медицинских наук, доктор наук, Кафедра неврологии и неврологии, Weill Cornell Medical College, Нью-Йорк, США
Ссылки
- Gage, F. H., Ray, J., Fisher, L. J. Isolation, characterization, and use of stem cells from the CNS. Annu. Rev. Neurosci. 18, 159-192 (1995).
- Vescovi, A. L., Snyder, E. Y. Establishment and properties of neural stem cell clones: plasticity in vitro and ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
