发展中国家斑马鱼的表皮细胞挤压实时成像
Summary
死亡的细胞被挤压协调一致的收缩邻近的细胞，上皮组织，而不破坏的屏障功能。发展中国家斑马鱼的光学清晰度提供了一个极好的系统，以可视化挤出生活上皮。在这里，我们描述的方法来诱导和幼虫斑马鱼的表皮细胞决议形象挤压。
Abstract
稳态维持上皮组织需要不断清除而不破坏的屏障功能受损的细胞。我们的研究发现，死亡的细胞信号传递给他们住邻居的形式和合同的肌动蛋白和肌球蛋白环弹出上皮表，而关闭任何可能导致其退出的差距，这个过程被称为细胞挤出1。发展中国家斑马鱼的光学清晰度提供了一个极好的系统，以可视化挤出生活上皮。在这里，我们描述了一种方法来诱导和幼虫斑马鱼表皮的形象挤出。可视化挤出，注射F -肌动蛋白红色荧光蛋白标记的探针进入细胞阶段在表皮表达绿色荧光蛋白的转基因斑马鱼的胚胎和诱导凋亡的G418除了幼虫。然后，我们使用一个旋转的光盘共聚焦显微镜成像技术观察在细胞凋亡挤出过程中的肌动蛋白动力学和上皮细胞行为的时间推移。这种方法使我们能够调查上皮细胞在活的挤压过程中，将提供一个途径研究由故障消除细胞凋亡引起的疾病状态。
Protocol
在发展中国家斑马鱼的表皮细胞挤压在肌动蛋白动力学的可视化的基本工作流程发展中国家斑马鱼的表皮是由两个不同的层，面层（或周皮）和基底层的细胞接触基底膜 2 。外表面层的细胞发生凋亡，并从组织消除挤出 3（图1） 。为了实时可视化这个过程中，我们注入的RNA编码红色荧光蛋白融合成单细胞阶段的转基因表达绿色荧光蛋白（GFP斑马鱼u…
Discussion
这里所描述的协议演示了一个简单而直接的方法来可视化挤压过程，在现场的上皮组织。这种类型的实验使我们以前没有固定组织分析赞赏的肌动蛋白动力学研究中的细微之处，因此，常见的免疫方法的补充。我们可以利用这个协议在组合化学抑制剂或基因突变体，以便更好地分析删除和清除细胞凋亡，我们期望与故障相关的挤压过程和研究疾病状态下会导致炎症反应或受损细胞的积累，为见于?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
罗森布拉特实验室的科学讨论，建议和意见，我们感谢成员。我们还要感谢玛丽哈洛伦请提供质粒RFP – UtrCH和大卫格伦沃尔德提供的CK：GFP转基因斑马鱼。还要感谢格蕾琴国王和良好的维护和斑马鱼的护理工作人员在犹他州立大学的集中斑马鱼资源。这项工作是由美国国立卫生研究院NIGMS美国国立卫生研究院主任的新的创新奖1 DP2 OD002056 – 01至JR支持。 GTE公司是由美国国立卫生研究院癌症多学科培训项目资助5T32 CA03247 – 8的支持。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
|---|---|---|---|---|
| RNeasy Mini Kit | Reagent | Qiagen | 74104 | |
| mMessage mMachine SP6 Kit | Reagent | Ambion | AM1340 | |
| Crossing Tanks | Tool | Thoren Aquatic Systems | ||
| The Pipet Pump | Tool | Bel Art Products | F3789 | |
| 5 ¾ Pasteur Pipet | Tool | VWR | 14672-608 | |
| Microinjection Mold | Tool | Adaptive Science Tools | I-34 | |
| 100x15mm Culture Plate | Tool | Fisher | 08-757-12 | |
| Flamming/Brown Micropipet Puller | Tool | Sutter Instrument Company | Model P97 | |
| Borosilicate Glass Capillaries with Filament | Tool | Sutter Instrument Company | B1400-78-10 | OD 1.0mm, ID 0.78mm, 10cm length |
| Electrode Storage Jar | Tool | World Precision Instruments | E210 | |
| Phenol Red | Reagent | Sigma | P0290 | 0.5% in DPBS |
| Pressure-Controlled Microinjector and Micromanipulator | Tool | Harvard Apparatus | PLI-100 | |
| 35x10mm Culture Dish | Tool | Cellstar | 627-160 | |
| G418 (Geneticin) | Reagent | GIBCO | 10131-035 | 50 mg/mL in dH20 |
| Dumont #5 Forceps | Tool | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| 12cm Pin Holder | Tool | Fine Science Tools | 26016-12 | |
| Insert Pins | Tool | Fine Science Tools | 26007-02 and-03 | |
| Glass Bottom Culture Dish with 1.5 coverglass | Tool | MatTek | P35G-1.5-10-C | |
| Low Melt Agarose | Reagent | Fisher | BP1360-100 | |
| Tricaine | Reagent | Sigma | A-5040 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Leica | MZ6 | |
| Dissecting Microscope | Microscope | Nikon | SMZ645 | |
| Fluorescent Dissecting Microscope | Microscope | Olympus | S2X12 | |
| Spinning Disc Confocal Microscope | Microscope | Nikon | Eclipse Ti | Outfitted with a Yokagawa spinning disc head |
| CCD Camera | Camera | Andor | DV-885-VP | 1002x1004x8 micron square pixels |
References
- Rosenblatt, J., Raff, M. C., Cramer, L. P. An epithelial cell destined for apoptosis signals its neighbors to extrude it by an actin- and myosin-dependent mechanism. Curr Biol. 11, 1847-1857 (2001).
- Le Guellec, D., Morvan-Dubois, G., Sire, J. Y. Skin development in bony fish with particular emphasis on collagen deposition in the dermis of the zebrafish (Danio rerio). Int J Dev Biol. 48, 217-231 (2004).
- Slattum, G., McGee, K. M., Rosenblatt, J. P115 RhoGEF and microtubules decide the direction apoptotic cells extrude from an epithelium. J Cell Biol. 186, 693-702 (2009).
- Burkel, B. M., Dassow, G. v. o. n., Bement, W. M. Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin. Cell Motil Cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).
- Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo. Dev Biol. 324, 236-244 (2008).
- Gong, Z. fluorescent protein expression in germ-line transmitted transgenic zebrafish under a stratified epithelial promoter from keratin8. Dev Dyn. 223, 204-215 (2002).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book, A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. , (2009).
- Curado, S., Stainier, D. Y., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).
Tags
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Cite This Article
Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689, doi:10.3791/2689 (2011).