Elastomeric PGS धमनी ऊतक इंजीनियरिंग में scaffolds
Summary
संवहनी चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं के साथ एक काँपने के गुणवाला प्रवाह bioreactor में सभ्य elastomeric PGS scaffolds देशी ECM उत्पादन के साथ एक अपेक्षाकृत कम संस्कृति की अवधि में होनहार छोटे व्यास धमनी constructs के लिए नेतृत्व कर सकते हैं.
Abstract
Cardiovascular disease is one of the leading cause of mortality in the US and especially, coronary artery disease increases with an aging population and increasing obesity1. Currently, bypass surgery using autologous vessels, allografts, and synthetic grafts are known as a commonly used for arterial substitutes2. However, these grafts have limited applications when an inner diameter of arteries is less than 6 mm due to low availability, thrombotic complications, compliance mismatch, and late intimal hyperplasia3,4. To overcome these limitations, tissue engineering has been successfully applied as a promising alternative to develop small-diameter arterial constructs that are nonthrombogenic, robust, and compliant. Several previous studies have developed small-diameter arterial constructs with tri-lamellar structure, excellent mechanical properties and burst pressure comparable to native arteries5,6. While high tensile strength and burst pressure by increasing collagen production from a rigid material or cell sheet scaffold, these constructs still had low elastin production and compliance, which is a major problem to cause graft failure after implantation. Considering these issues, we hypothesized that an elastometric biomaterial combined with mechanical conditioning would provide elasticity and conduct mechanical signals more efficiently to vascular cells, which increase extracellular matrix production and support cellular orientation.
The objective of this report is to introduce a fabrication technique of porous tubular scaffolds and a dynamic mechanical conditioning for applying them to arterial tissue engineering. We used a biodegradable elastomer, poly (glycerol sebacate) (PGS)7 for fabricating porous tubular scaffolds from the salt fusion method. Adult primary baboon smooth muscle cells (SMCs) were seeded on the lumen of scaffolds, which cultured in our designed pulsatile flow bioreactor for 3 weeks. PGS scaffolds had consistent thickness and randomly distributed macro- and micro-pores. Mechanical conditioning from pulsatile flow bioreactor supported SMC orientation and enhanced ECM production in scaffolds. These results suggest that elastomeric scaffolds and mechanical conditioning of bioreactor culture may be a promising method for arterial tissue engineering.
Protocol
Discussion
निर्माण तकनीक का उपयोग कर एक biodegradable यहाँ वर्णित elastomer कई विशेषताएं है. (1) एक साँचे में ढालना रिलीज hyaluronic एसिड (हा) के रूप में इस्तेमाल किया. चूंकि हा पानी घुलनशील है, पाड़ आसानी से यह पानी में भिगोने के बाद गिलास ढालना से जारी है. इस रिपोर्ट में, हम 1.0% / wt खंड हा समाधान के इस्तेमाल क्योंकि समाधान की कम एकाग्रता (<0.5% / wt खंड) चिपचिपा नहीं है और नीचे बहता है इतनी तेजी से जब हम यह ग्लास टयूबिंग के शीर्ष पर गिरने. कोट हा समाधान करने के लिए समान रूप से, हम ग्लास टयूबिंग खत्म रूप से फ़्लिप जब समाधान टयूबिंग के नीचे उड़ गए और इस कदम को दोहराया. यह हा कोटिंग अंतिम scaffolds रिहा करने के लिए हमारे निर्माण प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है. (2) हम ग्लास टयूबिंग में लवण को बनाए रखने के लिए गर्मी shrinkable आस्तीन (एचएस) का इस्तेमाल किया. चूंकि लवण घनी ग्लास टयूबिंग और एचएस आस्तीन के भीतरी दीवार के बीच अंतरिक्ष में खचाखच भरे थे, एच एस आस्तीन टयूबिंग के नीचे में खराद का धुरा और PTFE की अंगूठी को हटाने के बाद लवण बनाए रखा. हम आसानी से एक ओवन में 120 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट के लिए मोल्ड में डाल द्वारा एच एस आस्तीन सकता है निकालने के लिए, और फिर मिल ट्यूबलर नमक टेम्पलेट्स. (3) हम नमक संलयन विधि का इस्तेमाल किया. यह सर्वविदित है कि नमक संलयन विधि संलयन समय 10 अलग ताकना interconnectivity और यांत्रिक गुणों में सुधार कर सकते हैं. इसके अलावा, के बाद से हम PGS इस्तेमाल किया, मैक्रो – pores के leaching की प्रक्रिया के दौरान नमक कणों द्वारा उत्पादित थे, जबकि सूक्ष्म है pores की संभावना ग्लिसरॉल वाष्प द्वारा उत्पन्न थे इलाज के रूप में हम पहले 11 में वर्णित PGS के दौरान गठित . इस प्रकार, इस पद्धति का एक अलग स्थूल और सूक्ष्म संरचनाओं के साथ नमक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कणों हालत इलाज PGS अलग से झरझरा ट्यूबलर scaffolds बनाना क्षमता है.
bioreactor से यांत्रिक कंडीशनिंग काँपने के गुणवाला प्रवाह छिड़काव प्रदान की गई है (अधिकतम प्रवाह मतलब = 14 मिलीग्राम / मिनट, अधिकतम कतरनी तनाव = 15.3 Dyne / 2 सेमी, आवृत्ति = 0,5 – 1,7 हर्ट्ज) और physiologically PGS पाड़, जो करने के लिए नेतृत्व के साथ प्रासंगिक दबाव एसएमसी विकास और ओरिएंटेशन (4 छवि). इन परिणामों पिछले अध्ययनों कि इस आवृत्ति में चक्रीय खिंचाव रिपोर्टिंग और कतरनी तनाव एसएमसी 12 प्रसार, और ECM प्रोटीन 13,14 उत्पादन बढ़ जाती है के साथ संगत कर रहे हैं. एसएमसी विकास और उन्मुखीकरण के अलावा, PGS ECM प्रोटीन के उत्पादन समर्थित निर्माण, विशेष रूप से 3 सप्ताह की संस्कृति के भीतर circumferentially लोचदार फाइबर (छवि 5) bioreactor में संगठित है. कुछ एक छोटे व्यास धमनियों का निर्माण के रूप में एक elastomeric पाड़ का उपयोग अध्ययन यांत्रिक शक्ति और फट देशी 15 धमनियों, और अनुरूप स्पिनर 16,17 कुप्पी का उपयोग scaffolds में तेजी एसएमसी एकीकरण करने के लिए तुलनीय दबाव दिखा दिया है, जबकि कोई लोचदार फाइबर इन constructs में पाए गए. हमारे परिणाम बताते हैं कि bioreactor से चक्रीय रेडियल बढ़ाव यांत्रिक संकेत transduction और अधिक प्रभावी ढंग से SMCs PGS पाड़, जो की संभावना के संश्लेषण और संगठन elastin के योगदान में सुधार.
चूंकि संवहनी SMCs है कि हमारे दृष्टिकोण, मौन endothelium में ECM प्रोटीन का उत्पादन और यांत्रिक शक्ति में सुधार के एक नैदानिक सफल छोटे व्यास धमनी constructs विकसित करने के लिए आवश्यक हैं केवल कोशिकाओं थे. हमें सूचित किया है कि endothelial कोशिकाओं मिला हुआ है और हमारी संस्कृति शर्तों और यांत्रिक 9 कंडीशनिंग के तहत समर्थित phenotype प्रोटीन अभिव्यक्ति monolayer उत्पन्न SMCs के साथ सह – सुसंस्कृत. इसलिए, हमारे दृष्टिकोण के आधार पर यहाँ वर्णित, सह संस्कृति प्रयोग की शर्तों का संशोधन अगले कदम परिणामी constructs के कार्यों में सुधार और nonthrombogenic मजबूत उत्पन्न होगा, और आज्ञाकारी धमनी देशी धमनियों की तरह का निर्माण.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक डा. जिन गाओ PGS संश्लेषण, bioreactor सेटअप, डीआरएस के लिए व्यावहारिक चर्चा के लिए डॉ. पीटर Crapo के लिए धन्यवाद. मोहम्मद Ezzelarab और लंगूर मन्या धमनियों explanting के लिए वी वू. इस अध्ययन के राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (HL089658 R01) से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Hyaluronic acid sodium salt | Sigma-Aldrich | H7630 |
| Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 401757 |
| MCDB 131 | Mediatech | 15-100-CV |
| Fetal bovine serum | Lonza | BW14-502F |
| L-glutamine | Mediatech | 25-005-CV |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A62-500 |
| Antibiotic-antimycotic solution | Mediatech | 30-004-CI |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Mediatech | 21-031-CV |
| Tissue-Tek optimal cutting temperature compound, 4583 | Sakura Finetek | 25608-930 |
References
- The American Heart Association Statistics Committee Stroke Statistics Subcommittee. American Heart Association: Heart disease and stroke statistics-2009 update. Circulation. 119, 480-486 (2009).
- Isenberg, B. C., Williams, C., Tranquillo, R. T. Small-diameter artificial arteries engineered in vitro. Circ Res. 98, 25-35 (2006).
- Conte, M. S. The ideal small arterial substitute: a search for the Holy Grail. FASEB J. 12, 43-45 (1998).
- Wang, X., Lin, P., Yao, Q., Chen, C. Development of small-diameter vascular grafts. World J Surg. 31, 682-689 (2007).
- L’Heureux, N., Paquet, S., Labbe, R., Germain, L., Auger, F. A. A completely biological tissue-engineered human blood vessel. FASEB J. 12, 47-56 (1998).
- Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R. Functional arteries grown in vitro. Science. 284, 489-493 (1999).
- Wang, Y., Ameer, G. A., Sheppard, B. J., Langer, R. A tough biodegradable elastomer. Nat Biotechnol. 20, 602-606 (2002).
- Crapo, P. M., Gao, J., Wang, Y. Seamless tubular poly(glycerol sebacate) scaffolds: high-yield fabrication and potential applications. J Biomed Mater Res A. 86, 354-363 (2008).
- Gao, J., Ensley, A. E., Nerem, R. M., Wang, Y. Poly(glycerol sebacate) supports the proliferation and phenotypic protein expression of primary baboon vascular cells. J Biomed Mater Res A. 83, 1070-1075 (2007).
- Murphy, W. L., Dennis, R. G., Kileny, J. L., Mooney, D. J. Salt fusion: an approach to improve pore interconnectivity within tissue engineering scaffolds. Tissue Eng. 8, 43-52 (2002).
- Gao, J., Crapo, P. M., Wang, Y. Macroporous elastomeric scaffolds with extensive micropores for soft tissue engineering. Tissue Eng. 12, 917-925 (2006).
- Wilson, E., Mai, Q., Sudhir, K., Weiss, R. H., Ives, H. E. Mechanical strain induces growth of vascular smooth muscle cells via autocrine action of PDGF. J Cell Biol. 123, 741-747 (1993).
- Leung, D. Y., Glagov, S., Mathews, M. B. Cyclic stretching stimulates synthesis of matrix components by arterial smooth muscle cells in vitro. Science. 191, 475-477 (1976).
- Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue. Nat Biotechnol. 17, 979-983 (1999).
- Yang, J., Motlagh, D., Webb, A. R., Ameer, G. A. Novel biphasic elastomeric scaffold for small-diameter blood vessel tissue engineering. Tissue Eng. 11, 1876-1886 (2005).
- Stankus, J. J., Soletti, L., Fujimoto, K., Hong, Y., Vorp, D. A., Wagner, W. R. Fabrication of cell microintegrated blood vessel constructs through electrohydrodynamic atomization. Biomaterials. 28, 2738-2746 (2007).
- Nieponice, A., Soletti, L., Guan, J., Deasy, B. M., Huard, J., Wagner, W. R., Vorp, D. A. Development of a tissue-engineered vascular graft combining a biodegradable scaffold, muscle-derived stem cells and a rotational vacuum seeding technique. Biomaterials. 29, 825-833 (2008).
