Kvantifiering av cellulär inflammation i skadade / patologiska CNS med flödescytometri kompliceras av lipid / myelin skräp som kan ha liknande storlek och granulering till celler, minskar känsligheten / noggrannhet. Vi har avancerat en metod cellberedningen att ta bort myelinet skräp och förbättra cell upptäckt med flödescytometri i den skadade ryggmärgen.
Upptäckt av immunceller i den skadade centrala nervsystemet (CNS) genom morfologisk eller histologiska tekniker har inte alltid ges sant kvantitativ analys av cellulär inflammation. Flödescytometri är en sammanfattning av alternativ metod för att kvantifiera immunceller i den skadade hjärnan eller ryggmärgen vävnad. Historiskt sett har flödescytometri använts för att kvantifiera immunceller som samlas in från blod eller dissocierade mjälte eller bräss, och endast ett fåtal studier har försökt att kvantifiera immunceller i den skadade ryggmärgen med flödescytometri med färska dissocierade sladd vävnad. Dock är dissocierade ryggmärgsvävnad koncentrerad med myelin skräp som kan misstas för celler och minska celltal tillförlitlighet erhålls genom flödescytometern. Vi har avancerat en metod cellberedningen med OptiPrep lutning systemet för att effektivt skilja lipid / myelin skräp från celler, vilket ger känsliga och tillförlitliga kvantifieringar av cellulära inflammation i den skadade ryggmärgen med flödescytometri. Som beskrivs i vår senaste studie (Beck & Nguyen et al, Brain 2010 februari, 133 (Pt 2):.. 433-47) hade OptiPrep cellberedningen ökad känslighet för att upptäcka cellulär inflammation i den skadade ryggmärgen, med fall av specifika celltyper korrelera med skadornas svårighetsgrad. Kritiskt, förutsatt roman användning av denna metod den första karakterisering av akut och kronisk cellulär inflammation efter SCI att inkludera en komplett tidsintervall polymorfonukleära leukocyter (PMNs, neutrofiler), makrofager / mikroglia och T-celler under en period som sträcker sig från 2 timmar till 180 dagar efter skada (dpi), identifiera en överraskande roman andra fas av cellulär inflammation. Grundlig beskrivning av cellulära inflammationen med den här metoden kan ge en bättre förståelse för neuroinflammation i den skadade CNS, och avslöja en viktig multiphasic del av neuroinflammation som kan vara avgörande för utformningen och genomförandet av en rationell terapeutisk behandling strategier, inklusive både cellbaserade och farmakologiska interventioner för SCI.
Användningen av flödescytometri att kvantifiera immunceller i CNS kompliceras av lipid / myelin innehåll och skräp. Förutom att störa antikroppsbindning och specificitet kan myelin skräp har liknande storlek och egenskaper granulering till immunceller minskar mätkänslighet och noggrannhet 8. Romanen cellberedningen metoden som beskrivs här är effektiva för att avlägsna myelin skräp och därmed förbättrar känsligheten för flödescytometri för att upptäcka förändringar i cellulär inflammation i den skadade ryggmärgen. Till exempel avlägsnande av myelin skräp med denna metod förbättrad detektion av immunceller jämfört med enzymatisk dissociation alone.Critically tillät roman användning av denna metod den första karakterisering av akut och kronisk cellulär inflammation efter SCI att inkludera en komplett gången kurs för PMNs, makrofager / mikroglia och T-celler upp till 180 dpi, och identifierade en ny fas av cellulär inflammation. Dessa viktiga resultaten av en multiphasic del av neuroinflammation kan vara avgörande för utformningen och genomförandet av rationella terapeutisk behandling strategier, inklusive både cellbaserade och farmakologiska interventioner för SCI.
Det OptiPrep lutning systemet har använts för att skilja skräp från celler i blod 9 eller rena nervceller från hjärnan för ändamål cellodling 10, men vi har ändrat och avancerade metoden för att skilja myelin skräp från ryggmärgen dissocierade celler, och tillät snabb och mer exakt kvantifiering av cellulär inflammation genom flödescytometri. Denna metod tillsammans med flödescytometri kommer sannolikt att ge betydande framsteg inom inflammationsforskning efter CNS-skador eller sjukdomstillstånd, eftersom de flesta studier har bara präglats cellulära inflammationen i CNS med hjälp av morfologiska och histologiska tekniker som inte är celltyp specifika eller kan inte alltid sant kvantitativ bedömning. Dessutom har ett par nya studier försökt att kvantifiera immunceller i den skadade ryggmärgen med flödescytometri med färska dissocierade sladden vävnad 11,12 eller celler skiljs åt av Percoll gradient systemet 13, men har dessa studier visat antingen låg cell avkastning eller okänsliga upptäckt av immunceller.
Däremot har OptiPrep gradient cellberedningen metod som för första gången, känsliga och tillförlitliga kvantitativ bedömning med flödescytometri till förändringar av cellulär inflammation som svar på graderade skadornas svårighetsgrad och under en längre tidsförloppet upp till 180 dpi. Känslighet och tillförlitlighet flödescytometrianalyser också bero på specifika antikroppar som används för att påvisa specifika immunceller typer, gör som flödescytometri inte tillåta morfologiska kriterier för att ytterligare skilja celltyper. Specificiteten av antikroppar för PMNs, makrofager / mikroglia eller T-berättar har testats noggrant i flödescytometri för peritoneal PMNs och alveolära makrofager i kultur och celler i den skadade ryggmärgen vävnad 1,2. Tillsammans med OptiPrep lutning systemet har dessa antikroppar används för flödescytometri bidragit till uppkomsten av en tidsmässig och kvantitativ analys av cellulära inflammation som har gett nya insikter om dynamiken i SCI mikromiljö, och identifierades för första gången en längre multiphasic svar av cellulära inflammation. Denna multiphasic respons celler efter SCI kan vara viktigt att undersöka betydelsen av specifika celltyper närvarande på bestämda tider efter skada eller generera terapeutiska åtgärder mot specifika celltyper som kan förvärra skadorna. Dessutom kan dessa resultat bidra till utvecklingen av en lämplig motivering för den optimala drogen eller cellbaserade insatser för SCI.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Rebecca Nishi, MS, och tekniker för Christopher och Dana Reeve Foundation Animal Core Facility vid UC Irvine för deras hjälp i djur kirurgi. Vi vill också tacka Gabriella Funes, Usha Nekanti och Denisse Moreno för tekniskt stöd, manus och video shoot förberedelser och animation. Denna forskning stöds av NINDS (RO1 NS43428-01 till AJA), den Förlamning Project of America (PPA-32.574 till HXN) och California Institute för regenerativ medicin (CIRM) Stem Cell Utbildning Award T1-00008 till HXN. KDB stöddes av utbildningen i molekylära och cellulära neurovetenskap vid UC Irvine (T32 NS007444).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
OptiPrep | Fisher Scientific | NC9182490 |
HBSS | Sigma | H1387 |
Rabbit anti-rat PMN (FITC) | Accurate Chemical & Scientific | AIFAD51140 |
Mouse anti-rat ED1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA341A488 |
Mouse anti-rat CD3 (FITC) | AbD Serotec | MCA772F |
Trypsin | Sigma | T9935 |
Collagenase | Sigma | C5138 |
DME | Sigma | D1152 |
MOUSE IgG1 (Alexa Fluor 488) | AbD Serotec | MCA1209A488 |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH30070.03 |
Rabbit serum | Jackson ImmunoResearch | 011-000-120011-000-120 |
Mouse serum | Jackson ImmunoResearch | 015-000-120 |
Cell Strainer | BD Falcon | 352340 |