Niet-chirurgische intratracheale Instillatie van Muizen met Analyse van de longen en Lung drainerende lymfeklieren door middel van flowcytometrie
Summary
We illustreren niet-chirurgische levering van testmateriaal in de longen van verdoofde muizen via de luchtpijp. Deze methode laat long blootstelling aan bacteriële en virale pathogenen, cytokines, antistoffen, kralen, chemicaliën of kleurstoffen. We verder beschrijven oogst en verwerking van de longen en longen drainerende lymfeklieren (LDLNs) voor flowcytometrie.
Abstract
Fagocyterende cellen zoals alveolaire macrofagen en longen dendritische cellen (MOL's) continu monster antigenen van de alveolaire ruimten in de longen. MOL, in het bijzonder, staan bekend om te migreren naar de longen drainerende lymfeklieren (LDLNs), waar zij aanwezig is ingeademd antigenen aan T-cellen het openen van een juiste immuunreactie op een verscheidenheid van immunogenen 1,2. Voor het modelleren van interacties tussen de longen en in de lucht antigenen in muizen, kunnen antigenen intranasaal 1,3,4 worden toegediend, intratracheaal 5 of de vorm van aërosolen 6. Levering door elke route houdt in verschillende technische vaardigheden en beperkingen die moeten worden genomen voordat het ontwerpen van een experiment. Bijvoorbeeld, intranasale en aerosolized blootstelling levert antigenen aan zowel de longen en de bovenste luchtwegen. Vandaar dat antigenen kunnen toegang krijgen tot de neus daarmee verbonden lymfoïd weefsel (nalt) 7, potentieel bemoeilijkt de interpretatie van de resultaten. Daarnaast kunnen slikken, niezen en de ademhaling van de muis ook leiden tot inconsistenties in de geleverde doses. Hoewel de betrokkenheid van de bovenste luchtwegen kan de voorkeur voor sommige studies, kan het bemoeilijken experimenten gericht op gebeurtenissen die specifiek ingewijd in de longen. In deze instelling van de intratracheale (het) route de voorkeur omdat het testen van materialen levert direct in de longen en omzeilt de nalt. Velen injectie protocollen betrekking hebben op een blinde intubatie van de luchtpijp via de mondholte of chirurgische blootstelling van de luchtpijp naar de longen te openen. Hierin beschrijven we een eenvoudige, consistente, niet-chirurgische methode voor het instillatie. De opening van de luchtpijp wordt gevisualiseerd met behulp van een laryngoscoop en een gebogen naald maagsonde wordt dan rechtstreeks in de luchtpijp naar de innoculum te leveren. We beschrijven ook de procedures voor het oogsten en verwerken van LDLNs en longen voor de analyse van antigeen handel door flowcytometrie.
Protocol
Discussion
We hebben dit protocol gebruikt om de smokkel van Bacillus anthracis sporen van de longen naar de LDLNs bestuderen. Voor soortgelijke toepassingen, moet het aantal deeltjes geleverd aan de longen zorgvuldig worden gekozen, zodat de geïnjecteerde materiaal kan worden gedetecteerd in de LDLNs door flowcytometrie. We hebben ook met succes gebruik gemaakt van deze methode voor adoptieve overdracht van cellen en etikettering van specifieke long celpopulaties met behulp van fluorescent gelabelde antilichamen. Bovend…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 70μm Cell stariner | BD | ||
| Aniline Blue | Fisher | A967-25 | |
| Animal Feeding needle | Popper and Sons Inc | 7920 | |
| Collagenase | Sigma | C2139 | |
| Collagenase TypeIV | Worthington | ||
| Collagenase D | Roche | 11088974103 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Fluoresbrite YG Microspheres (0.5μm) | Polysciences, Inc | 17152 | |
| HBSS without Calcium chloride and magnesium chloride | Invitrogen | 14170 | |
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Hospira Inc | ||
| Laryngoscope Blade | PennCentury, Inc | For Model LS-1 | Refer to www.penncentury.com |
| Lightweight Fiber Optic Laryngoscope | WelchAllyn | 80814 | |
| Red Fluorescent Beads (0.5μm) | Invitrogen | F8812 | For i.p injection |
| Xylazine (100mg/ml) | Lloyd Laboratories |
References
- Grayson, M. H. Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection. J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).
- GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. N. Division of labor between dendritic cell subsets of the lung. Mucosal Immunol. 1, 442-442 (2008).
- Bar-Haim, E. Interrelationship between dendritic cell trafficking and Francisella tularensis dissemination following airway infection. PLoS Pathog. 4, e1000211-e1000211 (2008).
- Kim, T. S., Braciale, T. J. Respiratory dendritic cell subsets differ in their capacity to support the induction of virus-specific cytotoxic CD8+ T cell responses. PLoS One. 4, e4204-e4204 (2009).
- Bakocevic, N., Worbs, T., Davalos-Misslitz, A., Forster, R. T cell-dendritic cell interaction dynamics during the induction of respiratory tolerance and immunity. J Immunol. 184, 1317-1317 (2010).
- Thomas, R. J. Influence of particle size on the pathology and efficacy of vaccination in a murine model of inhalational anthrax. J Med Microbiol. , (2010).
- Kiyono, H., Fukuyama, S. NALT- versus Peyer’s-patch-mediated mucosal immunity. Nat Rev Immunol. 4, 699-699 (2004).
- Parungo, C. P. Lymphatic drainage of the peritoneal space: a pattern dependent on bowel lymphatics. Ann Surg Oncol. 14, 286-286 (2007).
- Jakubzick, C., Helft, J., Kaplan, T. J., Randolph, G. J. Optimization of methods to study pulmonary dendritic cell migration reveals distinct capacities of DC subsets to acquire soluble versus particulate antigen. J Immunol Methods. 337, 121-121 (2008).
- Higgins, D. M. Relative levels of M-CSF and GM-CSF influence the specific generation of macrophage populations during infection with Mycobacterium tuberculosis. J Immunol. 180, 4892-4892 (2008).
- Kool, M. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells. J Exp Med. 205, 869-869 (2008).
- Costa, D. L., Lehmann, J. R., Harold, W. M., Drew, R. T. Transoral tracheal intubation of rodents using a fiberoptic laryngoscope. Lab Anim Sci. 36, 256-256 (1986).
- Takahashi, S., Patrick, G. Patterns of lymphatic drainage to individual thoracic and cervical lymph nodes in the rat. Lab Anim. 21, 31-31 (1987).
- Broeck, W. V. a. n. d. e. n., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. J Immunol Methods. 312, 12-12 (2006).
