Nos ilustran no quirúrgico de entrega de materiales de prueba en los pulmones de ratones anestesiados a través de la tráquea. Este método permite la exposición del pulmón a los patógenos bacterianos y virales, las citocinas, los anticuerpos, los granos, productos químicos, ni colorantes. Nos describen con más detalle la recolección y procesamiento de los pulmones y ganglios linfáticos de drenaje del pulmón (LDLNs) por citometría de flujo.
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Artículo de método
No quirúrgico instilación intratraqueal de ratones con el análisis de los pulmones y ganglios linfáticos de drenaje del pulmón por citometría de flujo
En este artículo
Resumen
Resumen
Fagocitos como los macrófagos alveolares y las células dendríticas del pulmón (PMA) de forma continua muestra los antígenos de los espacios alveolares de los pulmones. Los países menos adelantados, en particular, se sabe que migran a los ganglios linfáticos pulmonares drenan (LDLNs) donde presentan antígenos inhalados a las células T de iniciar una respuesta inmune apropiada a una variedad de inmunógenos 1,2. A las interacciones del modelo entre los pulmones y los antígenos en el aire en los ratones, los antígenos se puede administrar por vía intranasal 1,3,4, intratraqueal 5 o 6 en forma de aerosoles. La entrega por cada ruta incluye distintas habilidades técnicas y las limitaciones que deben tenerse en cuenta antes de diseñar un experimento. Por ejemplo, la exposición intranasal en aerosol y ofrece tanto a los antígenos de los pulmones y el tracto respiratorio superior. Por lo tanto, los antígenos pueden acceder a la nasal de tejido linfoide asociado (NALT) 7, lo que podría complicar la interpretación de los resultados. Además, la deglución, el estornudo y la tasa de respiración del ratón también puede dar lugar a incoherencias en las dosis administradas. Aunque el compromiso del tracto respiratorio superior puede ser preferible para algunos estudios, puede complicar los experimentos se centra en los eventos específicamente iniciado en los pulmones. En este contexto, la intratraqueal (IT) es preferible, ya que proporciona los materiales de prueba directamente en los pulmones y pasa por el NALT. Muchos protocolos de inyección incluyen la intubación o ciegos de la tráquea a través de la cavidad oral o la exposición quirúrgica de la tráquea para acceder a los pulmones. En este documento, se describe un simple y consistente, método no quirúrgico para la instilación. La apertura de la tráquea se visualizan mediante un laringoscopio y una aguja doblada sonda se inserta directamente en la tráquea para entregar el inóculo. También se describen los procedimientos para la recolección y procesamiento de LDLNs y los pulmones para el análisis del tráfico de antígeno por citometría de flujo.
Protocolo
1. Antes del proceso, preparar y reunir los siguientes
- Por favor refiérase a la imagen de la Figura 1a) y 1b) para la construcción de una plataforma de madera para contener el ratón durante el procedimiento.
- Digestión de la mezcla de los ganglios linfáticos - HBSS + 1.25mg/ml colagenasa TypeIV o 2,5 mg / ml de colagenasa D
- Mezcla de digestión para los pulmones - HBSS + 1 mg / ml de colagenasa
- Diluir las gotas de látex (1:20) en PBS durante la inyección intraperitoneal de visualizar el LDLNs
Nota: LDLNs son pequeños y difíciles de encontrar. Para saber cómo se encuentran, se i....
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Discusión
Hemos utilizado este protocolo para estudiar el tráfico de esporas de Bacillus anthracis de los pulmones a la LDLNs. Para aplicaciones similares, el número de partículas llega a los pulmones deben ser elegidos cuidadosamente para que el material inyectado puede ser detectado en el LDLNs por citometría de flujo. También se ha utilizado con éxito este método para la transferencia adoptiva de células y el etiquetado de poblaciones específicas de pulmón de células con anticuerpos marcados con fluorescencia. Además,.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios (opcional) |
| Stariner celular 70μm | BD | ||
| Anilina azul | Pescador | A967-25 | |
| Aguja de alimentación de los animales | Popper y Sons Inc | 7920 | |
| Colagenasa | Sigma | C2139 | |
| Colagenasa TypeIV | Worthington | ||
| Colagenasa D | Roche | 11088974103 | |
| DPBS | Invitrogen | 14190 | |
| Fluoresbrite YG microesferas (0.5μm) | Polysciences, Inc | 17152 | |
| HBSS sin cloruro de calcio y cloruro de magnesio | Invitrogen | 14170 | |
| La ketamina HCl (100mg/ml) | Hospira Inc | ||
| Hoja de laringoscopio | PennCentury, Inc | Para el modelo LS-1 | Se refieren a www.penncentury.com |
| Ligero de laringoscopio de fibra óptica | WelchAllyn | 80814 | |
| Red bolas fluorescentes (0.5μm) | Invitrogen | F8812 | Para la inyección ip |
| Xilazina (100mg/ml) | Lloyd Laboratorios |
Referencias
- Grayson, M. H. Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection. J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).
- GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. N. Division of labor between dendritic cell subsets of the lung. Mucosal Imm....
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Reimpresiones y permisos
