Cell בתיווך (CML) מבחני lymphocytotoxicity ניתן להשתמש כדי לבדוק את התגובות autoreactive מנגנוני המחקר של מוות של תאים במבחנה. עם זאת, שימוש לחיות תאים confocal טכניקות הדמיה מיקרוסקופית עם צבעי ניאון, סוג קינטיקה של מוות של תאים, כמו גם את המסלולים מנוצל ניתן ללמוד ביתר פירוט.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
שיטות להעריך מתווכת בטא מוות של תאים על ידי לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות
במאמר זה
סיכום
תקציר
סוכרת מסוג 1 (T1D) הוא תא T בתיווך מחלה אוטואימונית. במהלך בפתוגנזה, חולים הופכים בהדרגה insulinopenic יותר כמו ייצור אינסולין הוא איבד, ככל הנראה זו תוצאה של הרס תאים בטא בלבלב על ידי ותאי T. הבנת מנגנוני מוות של תאים בטא במהלך הפיתוח של T1D יספק תובנות כדי ליצור תרופה יעילה למחלה זו. Cell בתיווך (CML) מבחני lymphocytotoxicity השתמשו בעבר כרום רדיונוקלידים 51 (51 Cr) לתייג התאים היעד. מטרות אלו נחשפים מכן מפעיל תאים ושחרור של 51 Cr מתאי המטרה היא לקרוא כאינדיקציה המוות הלימפוציטים בתיווך התא. מעכבי תוצאה של התא למוות לשחרר ירידה של 51 Cr.
כמו תאים מפעיל, השתמשנו האוכלוסייה מופעל המשובטים autoreactive של CD8 + ציטוטוקסיות לימפוציטים מסוג T (CTL) מבודד מהונדס עכבר המניות אלפא וגם שרשראות בטא של קולטן T AI4 תא (TCR). הופעל AI4 בתאי T היו שיתוף תרבותי עם 51 Cr שכותרתו ניט תאים היעד במשך 16 שעות, שחרור של 51 Cr נרשמה לחשב תמוגה ספציפי
המיטוכונדריה להשתתף באירועים רבים פיזיולוגיים חשובים כגון הפקת אנרגיה, ויסות איתות התמרה, ו אפופטוזיס. המחקר של בטא שינויים התא המיטוכונדריה תפקודית במהלך הפיתוח של T1D הוא אזור הרומן של המחקר. שימוש המיטוכונדריה פוטנציאל הממברנה לצבוע Tetramethyl Rhodamine מתיל אסתר (TMRM) הדמיה confocal מיקרוסקופיים תא חי, אנחנו במעקב פוטנציאל קרום המיטוכונדריה לאורך זמן בתור תא בטא ניט-1. עבור בדיקות הדמיה, מפעיל AI4 בתאי T תויגו עם פלורסנט גרעיני מכתים צבע Picogreen. ניט-1 ותאי T היו שיתוף בתרבית החדרים coverglass ועלה על הבמה מיקרוסקופ המצויד בתא תא חי, מבוקר על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2, ו humidified. במהלך ניסויים אלה התמונות נלקחו של כל אשכול כל 3 דקות עבור 400 דקות.
במהלך של 400 דקות, צפינו את פיזור פוטנציאל קרום המיטוכונדריה ניט-1 אשכולות התא שבו AI4 בתאי T צורפו. בניסוי שליטה בו זמנית איפה ניט-1 התאים היו שיתוף תרבותי עם MHC אי - התאמה האדם תאים לימפוציטים Jurkat, פוטנציאל ממברנת המיטוכונדריה נותרו על כנן. טכניקה זו ניתן להשתמש כדי לצפות בזמן אמת שינויים בפוטנציאל הממברנה של המיטוכונדריה בתאים תחת מתקפה של לימפוציטים, ציטוקינים ציטוטוקסיות, או ריאגנטים ציטוטוקסיות אחרות.
פרוטוקול
1. הכנת התאים
- תא היעד תרבות: תרבות של בטא עכבר שורות תאים, ניט-1 ו אנבה-4, היה 1,2 תיאר בעבר DMEM בתוספת 10% FBS, BSA 0.02%, שאינן חיוניות חומצות אמינו, 15mm HEPES, 16.5mM Glocose ו פניצילין / סטרפטומיצין. במשך 51 תיוג Cr, בתאי הזרע צלחת שטוחה לתחתית-96 גם בתרבות ב 5X10 4 תאים / טוב בינוני 200 μl תרבות. עבור מיקרוסקופיה ניסויים בתאי הזרע 8-היטב Lab-טאק II החדרים coverglass ב 5x10 4 לכל תא בינוני 500 μl תרבות, ולאפשר לגדול במשך 48 שעות לפני השימוש בניסויים cytotoxicity.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
ציטוטוקסיות T בטא בתיווך התא מוות של תאים הוא פתופיזיולוגיה העיקרי של T1D 5. מבחני CML באמצעות שחרור 51 Cr לאפשר לנו ללמוד את מידת התגובה היעד מפעיל-6. עם זאת, תהליך מפורט מסלולים המוות T התא בתיווך תא הבטא עדיין לא הבינו באופן מלא. מאז המיטוכונדריה הן קריטיות לתפקוד התא בטא ומוות 7, התמקדנו שינויים המיטוכונדריה במהלך CML חזותית. פיזור מיטוכונדריאלי פוטנציאל הממברנה היא צעד מוקדם ובלתי הפיך במהלך שינויים פונקציונליים המיטוכונדריה המוביל .......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
ניסויים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות שנקבעו על ידי אוניברסיטת פלורידה Animal Care מוסדיים ועדת שימוש.
תודות
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הלאומי לבריאות DK074656 ו AI56374 (CEM), כמו גם את הקרן למחקר סוכרת נעורים.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | הערות (אופציונלי) |
| CR-51 | פרקין אלמר | NEZ030500IMC | |
| PBS | Cellgro | 21-040-60 | |
| Tetramethyl Rhodamine מתיל אסתר (TMRM) | Invitrogen | T668 | |
| Picogreen | Invitrogen | P7581 | |
| AI4 mimotope | mimotopes.com | רצף חומצות אמינו: YFIENYLEL | |
| IL-2 | R & D | 485-MI | |
| DMEM | Invitrogen | 11885 | |
| FBS | HyClone | SH30071.03 | |
| שור סרום אלבומין | סיגמא | A8412 | |
| HEPES | Cellgro | 25-060-Cl | |
| ממ שאינם חיוניים חומצות אמינו | GIBCO | 11140 | |
| פניצילין / סטרפטומיצין | מזל תאומים | 400-109 | |
| פנול אדום ללא DMEM | סיגמא | D5303 | |
| החממה CO2 | תרמו פישר | HeraCell 150i | שמרו סטרילי עבור תרבית תאים |
| בטיחות ביולוגית הממשלה | תרמו פישר | פורמה 1440 | |
| תרבות צינורות פנויה, 6x50 מ"מ זכוכית ליים | דיג | 14-958-A | |
| גמא מונה | פרקין אלמר | אשף אוטומטי 1470 מונה גמא | |
| Confocal מיקרוסקופ | Zeiss | LSM 510 Meta Confocal | עם הבמה ממונע תא תא חי |
| פיפטה (1ml, 200μl, 20μl, 10μl, 2μl) | Eppendorf | ||
| צינורות (אמבר) | דיג | 50819772 | |
| סרכזת | Sorvall מקרא RT + | 75004377 | |
| Hemacytometer | פישר סיינטיפיק | 267110 | |
| זקוף מיקרוסקופ | Zeiss | Axioskop40 | |
| NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcraAI4) 1Dvs/DvsJ עכברים | ג'קסון מעבדה | 004347 | |
| NOD.Cg-Rag1 tm1Mom Tg (TcrbAI4) 1Dvs/DvsJ עכברים | ג'קסון מעבדה | 004348 | |
| NOD-AI4α / עכברים F1 β | N / A | N / A | Bred במתקן חיה UF |
מקורות
- Hamaguchi, K., Gaskins, H. R., Leiter, E. H. NIT-1, a pancreatic beta-cell line established from a transgenic NOD/Lt mouse. Diabetes. 40, 842-849 (1991).
- Chen, J., Gusdon, A. M., Piganelli, J., Leiter, E. H., Mathews, C. E. mt-Nd....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
