Ex Cultura Vivo di cellule primarie umane tube di Falloppio epiteliale

Summary

Le tube di Falloppio (FT) sta emergendo come un sito alternativo di origine per il carcinoma ovarico sieroso (SOC). Questo protocollo descrive un nuovo metodo per l'isolamento e la<em> Ex vivo</emCultura> delle cellule epiteliali tube di Falloppio. Questo sistema racchiude in sintesi il<em> In vivo</emEpitelio> e permette lo studio della patogenesi SOC.

Abstract

Carcinoma ovarico epiteliale è una delle principali cause di mortalità per tumore femminile negli Stati Uniti. A differenza di altre donne-specifici tumori, come il carcinoma della mammella e dell'utero, in cui i tassi di mortalità sono diminuiti negli ultimi anni, i tassi di curare il cancro ovarico sono rimasti relativamente invariati negli ultimi due decenni ^1. Ciò è dovuto alla mancanza di adeguati strumenti di screening per la rilevazione di malattia in stadio precoce, dove la chirurgia e la chemioterapia sono più efficaci ^{2, 3.} Di conseguenza, la maggior parte dei pazienti presentano con malattia in stadio avanzato e diffuso coinvolgimento addominale. Questo è ulteriormente complicato dal fatto che il cancro ovarico è una malattia eterogenea con più sottotipi istologici ^{4, 5.} Carcinoma ovarico sieroso (SOC) è il sottotipo più comune e aggressivo e la forma più spesso associata a mutazioni nei geni BRCA. Attuali modelli sperimentali in questo campo prevedono l'utilizzo di linee cellulari tumorali e modelli di mouse per capire meglio gli eventi iniziare genetica e la patogenesi della malattia ^{6, 7.} Recentemente, le tube di Falloppio è emerso come un sito innovativo per l'origine della SOC, con le tube di Falloppio (FT) secretoria delle cellule epiteliali (FTSEC) come la cellula di origine proposto ^{8, 9.} Attualmente non ci sono linee cellulari o sistemi di coltura a disposizione per studiare l'epitelio FT o il FTSEC. Qui si descrive un nuovo sistema ex vivo cultura in cui sono coltivate le cellule primarie FT epiteliali umane in un modo che preservi la loro architettura, polarità, immunofenotipo, e la risposta a fattori di stress fisiologico e genotossico. Questo modello ex vivo fornisce un utile strumento per lo studio della SOC, permettendo una migliore comprensione di come i tumori possono derivare da questo tessuto, ei meccanismi coinvolti nella progressione del tumore e di iniziazione.

Protocol

1. Collagene Preparazione e rivestimento del filtro. Per preparare collagene umano placentare, tweeze da 30 mg di collagene umano placentare e messo al di sopra di 50 ml di acqua distillata (dH 2 O) in un bicchiere da 500 ml con ancoretta. Aggiungere 100 μls di acido acetico glaciale direttamente sul collagene per rendere più facile a dissolversi. Calda a 37 ° C e mescolate per sciogliere il collagene. Deve sciogliere in 20-30 minuti. Se filamenti di collagene rimangono in soluzione, la sterilizzazione del filtro sarà difficile. Diluire il magazzino 50 ml con 450 ml di dH 2 O e filtro sterilizzare con una membrana di 0,2 micron. Questa è la soluzione finale di lavoro. Conservare a 4 ° C. Preparare membrane Transwell filtro rivestendoli con collagene (50-100 mL) durante la notte. Collagene refrigerata deve essere riscaldato a RT e poi aggiunto al vano superiore per coprire la membrana durante la notte ed a temperatura ambiente. Prima di placcatura il dissociato tubo primario di Falloppio (FT) epitelio (vedi sotto) sulla filtri Transwell, lavare i filtri per tre volte in 1X tampone fosfato salino (PBS) almeno 1 ora prima dell'uso per rimuovere l'eccesso di collagene. 2. Tessuto Raccolta e dissociazione. Fresco tube di Falloppio (FT) fimbria deve essere raccolto in sterili 1X PBS in un tubo da centrifuga da 50 ml e tenuta in ghiaccio prima della richiesta di elaborazione in una cappa sterile coltura di tessuti. Lavare il campione di tessuto, una volta raffreddata in 20 ml di PBS 1X (se il campione è stato raccolto in un altro tipo di supporto o lavare sanguinosa almeno 3 volte di liberarsi di come molto sangue e dei media stranieri il più possibile in quanto ciò potrebbe interferire con l'efficienza placcatura). Utilizzando una pinzetta sterile FT trasferimento ad un piatto della cultura 10 centimetri di tessuto con un po 'di PBS e, utilizzando una pinzetta sterile bisturi e sterile, tagliato longitudinalmente per massimizzare l'esposizione delle cellule epiteliali. Aprire la fimbria in modo che non è più un tubo, ma un foglio quasi piatto di tessuto. Poi tagliato in pezzi più piccoli, ma ancora recuperabili (circa 3 mm di diametro). Trasferimento pezzi da 45 ml di acqua refrigerata dissociazione media (MEM contenente 1,4 mg / ml pronasi e 0,1 mg / ml di DNAsi) in una provetta da 50 ml. Roccia dolcemente a 4 ° C per 24 a 72 ore. (Per esperienza, 48 ore è ottimale). Per controllare quantità di dissociazione, mettere una goccia di dissociazione dei media su un vetrino e controllare quantità di aggregazione e di vitalità del tessuto (battendo cellule ciliate). Vuoi vedere entrambe le celle singole e alcune macchie di piccole dimensioni. 3. Tubo placcatura di Falloppio. Quando la quantità di dissociazione delle cellule epiteliali è ottimale, inattivare i media aggiungendo il 10% del volume di FBS. Invertire un paio di volte per rimuovere la sospensione cellulare in piccoli aggregati. Lasciare grumi di tessuto di grandi dimensioni (tessuto stromale) a stabilirsi sul fondo della provetta. Rimuovere i supporti contenenti le cellule epiteliali in un secondo tubo da 50 ml. Aggiungere 50 ml di MEM freddo (senza FBS) per l'originale tubo da 50 ml. Inverti per raccogliere le cellule aggiuntivi. Raccogliere i media in un terzo tubo da 50 ml (se il campione è molto grande e un elevato numero di cellule è previsto, questo passaggio può essere ripetuto per massimizzare la raccolta delle cellule). Le grandi pezzi di tessuto stromale / extracellulare può essere scartata. Ora avete due provette da 50 ml di sospensione cellulare. Centrifugare a 1000 rpm per 5 minuti e aspirare i media dissociazione da pellet cellulari. Risospendere in circa 5-10 ml di USG media (DMEM: F12 integrato con il 2% e 1% USG Pen Strep) riscaldato a 37 ° C. Pipettare delicatamente. Fare attenzione a non pipetta anche con forza, poiché ciò potrebbe danneggiare le cellule epiteliali e ridurre la qualità delle culture. Ci dovrebbe essere celle singole e piccoli grumi (Figura 1). Trasferimento su piatti cultura Primaria e incubare per un minimo di 1 ora o fino a 3 ore. Fibroblasti e cellule rosse del sangue si attacca alla plastica, ma le cellule epiteliali FT non lo faranno. Date un'occhiata al piatto dopo un'ora per vedere se qualcosa è attaccare. La presenza di cellule ciliate può essere visto da notare il battito delle ciglia. Durante questa incubazione, filtri collagene rivestito può essere lavato e pronto per placcatura cella (vedi punto 1.4) Dopo 1-3 ore di incubazione sulle piastre Primaria, trasferire la sospensione di cellule in una provetta da 15 ml e lavare la piastra Primaria con 5 ml di USG media, trasferire questo supporto al tubo per rendere un volume finale di 15 ml. Centrifugare a 1000 rpm per 5 minuti. Attenzione dei media e aspirare evitare di perturbare il pellet. A giudicare dalle dimensioni pellet, risospendere in quantità appropriata di USG media. (Di solito tra ml 1-3) Meno è meglio all'inizio in modo che si possa diluire ulteriormente se necessario. Risospendere delicatamente. Aggiungere 10 ml di cellule risospese ad una emocitometro e determinare la densità cellulare. Suggerimenti: Siete alla ricerca di cellule epiteliali che hanno una membrana cellulare decisamente scuro e non sono colonnare. Si può anche contare le cellule ciliate che sono decisamente in movimento. Celle più piccole che hanno un alone appearance sono i globuli rossi e non devono essere conteggiati. Ci saranno alcune aggregazione, quindi è necessario stimare che in te conta delle cellule. Il target semina è 1,65 x10 5 cellule / a membrana, o almeno il 75% di copertura del filtro (Figura 1). Se le cellule sono placcati troppo poco, le cellule non saranno in grado di formare uno strato epiteliale completa. Aggiungere 500 l di media USG al fondo del pozzetto di una piastra ben 24 e inserire Transwell. Il volume di sospensione cellulare FT (vedi sopra) possono essere aggiunti su ogni membrana, questo è in genere 100 ul. Incubare e far crescere per 1-2 giorni senza disturbare superiore della membrana. È possibile modificare il supporto sul lato basale in quei giorni se necessario. Dopo 1-2 giorni, è possibile lavare accuratamente la superficie con USG media e aggiungere una piccola quantità (50-100 mL) dei media sulla parte superiore della membrana. E 'più facile determinare la confluenza di colture cellulari se il supporto viene rimosso dalla parte apicale dei filtri prima di microscopia. Lo scomparto inferiore deve sempre contenere i media. Una volta che le culture sono completamente confluenti (di norma entro 5 giorni), la quantità di materiale che viaggia attraverso i filtri dal basale ai lati apicale dovrebbe essere trascurabile. Cambiare il supporto basale una volta ogni due giorni per i primi 10 giorni. Lo scomparto inferiore deve sempre avere un supporto per mantenere le cellule vive. Una volta che le cellule hanno formato uno strato epiteliale stretto (Figure 1 e 2) possono essere utilizzati in ulteriori studi, come immunofluorescenza (IF) o immunoistochimica (IHC). 4. Membrana di elaborazione. Elaborazione membrana dipende dal tipo di studio che verrà eseguita, ma in genere comporta la rimozione del filtro da inserti Transwell. I filtri sono normalmente lavati 3 volte in 200 ml di PBS 1X prima della rimozione. Aspirare il PBS da parte apicale e basale dei filtri. Questo dovrebbe essere fatto 1 vasca alla volta per evitare che le membrane si secchi. Rimuovere l'inserto dalla piastra, lancia a testa in giù e usare un bisturi sterile per tagliare intorno alla membrana. Tenta di rimuovere la membrana in un unico pezzo mediante tagli dritti lungo il bordo della membrana, invece di trascinare il bisturi intorno al bordo. Utilizzare le pinzette per rimuovere il filtro dal inserto, tenere traccia di quale lato le cellule sono in. Il filtro può quindi essere trattati per IF, IHC, ecc a seconda dei casi. Esempio: per IF studi, il filtro (dopo la fissazione, permeabilizzazione, il blocco e l'incubazione con gli anticorpi del caso, secondo le procedure standard IF) deve essere immesso in una diapositiva, le cellule rivolto verso l'alto Vectashield con DAPI è caduto sul filtro e coperto con un vetro coprioggetto. 5. Rappresentante dei risultati: I filtri transwell può essere facilmente rimosso per esaminare l'epitelio ex vivo da entrambi i immunoistochimica (IHC) e di immunofluorescenza (IF). Utilizzando lignaggio marcatori specifici, si può immagine e quantificare i secretoria (PAX8 positivo) e ciliate (Sall2 positivo) compartimenti cellulari in queste culture (Figura 3). Inoltre, utilizzando questi indicatori, si può monitorare ogni tipo di cellula risponde a diversi stimoli fisiologici 10. Questo sistema è stato utilizzato per caratterizzare i cambiamenti nel phosphoproteome secretome e intracellulare di epitelio FT in risposta a stimoli diversi. Figura 1. Illustrazione raffigura come ex culture vivo sono generati dalla scuola primaria tessuti umani tuba di Falloppio. Tessuti tuba fimbrial è ottenuto dalla sala operatoria e tritate per generare piccoli frammenti 1, che vengono lavate e incubate con dissociazione dei media per 24-72 ore 2. Dopo la dissociazione è completa, i frammenti di tessuto sono lasciati depositare in fondo al tubo di incubazione e che i supporti contenenti le cellule epiteliali dissociate viene raccolto 3. L'efficienza di dissociazione può essere monitorato con l'esame al contrasto di fase 4 microscopio. Le cellule epiteliali dissociate vengono poi coltivate in piastre Primaria per contribuire a rimuovere fibroblasti e cellule ematopoietiche che invariabilmente mescolati con le cellule epiteliali 5. Una volta che il non-epiteliali cellule siano adeguatamente rimossi, le cellule epiteliali sono seminate su filtri transwell che sono rivestite di collagene umano placentare 5. Il supporto è fornito per diffusione attraverso la transwell dal basso. Le colture vengono incubate per 24-48 ore e poi i media apicale è stato rimosso. Le colture ex vivo sono poi permesso di crescere per 5-8 giorni per formare un completo, prato completa sui filtri transwell. Le culture ex vivo può essere mantenuto in questo stato validamente per un massimo di 4 settimane. Il cartone animato 5 mostra una rappresentazione della cultura completamente cresciuto ex vivo con un esempio di un filtro rimosso dalla inserire e macchiato di ematoxylin e eosina (H & E) per dimostrare la polarità e l'architettura dell'epitelio ex vivo. Figura 2. Microscopia in campo chiaro di FT ex culture vivo. Transwell inserti sono rivestiti con pori collagene umano placentare 0.4μm sono visibili (a). FT cellule epiteliali sono coltivate sul collagene inserti rivestiti (b), dove formano uno strato epiteliale (c). Alcuni detriti è normalmente osservato aderire alle cellule epiteliali della cultura (indicato dalle frecce), più spesso per le cellule ciliate. Figura 3. FT ex vivo della cultura di immunofluorescenza (IF). Esempi di IF immagini di culture ex vivo fissate e colorate con anticorpi contro (a) secretoria (PAX8) e (d) delle cellule ciliate (Sall2) i marcatori. DAPI viene utilizzato come controllo per la localizzazione dei nuclei cellulari (blu) (b ed e) e degli anticorpi fusi e colorazione DAPI è anche mostrato (C e F). Il numero delle cellule dipende dalla lunghezza del tempo le cellule sono in coltura (PAX8 colorazione, 7 giorni; Sall2 colorazione, 3 giorni).

Discussion

L'identificazione del FT come un sito candidato di origine per SOC offre l'opportunità di ricerca di base e traslazionale volti a decifrare i meccanismi che collegano noti fattori di rischio e l'attuale processo di sierosa cancerogeni. Critico per questo è lo sviluppo di sistemi modello docile che ci permetterà di iniziare a testare l'ipotesi che l'FTSEC è una cella di origine per pelvico carcinomi sierosi. L'ex modello di cultura vivo qui descritto è un nuovo sistema che permette l'isolamento e la co-coltura di secretoria FT primarie e cellule ciliate in un modo che preservi la morfologia e la biologia dell'epitelio FT nativi. Utilizzando questo sistema, abbiamo recentemente caratterizzato il secretome di questo epitelio e come l'epitelio risponde al danno meccanico e genotossico ^10. L'ovulazione, un importante fattore di rischio associato a tumorigenesi ovarico, è caratterizzato da una combinazione di danno tissutale, mediatori infiammatori, fattori di crescita e ormoni ^11. Questo sistema potrebbe essere usato per studiare l'effetto di un ambiente ovulatoria sulla risposta e la vitalità delle cellule ciliate e secretorie. Inoltre, l'impatto di altri tipi di cellule (cellule infiammatorie ad esempio) potrebbe essere esaminate per consentire una migliore comprensione degli eventi che determinano la differenziazione delle cellule di tipo ei fattori che contribuiscono alla trasformazione neoplastica delle cellule. Modelli simili sono stati descritti in altri tessuti dove epitelio polarizzato è presente. Per esempio, nel polarizzata colture primarie di epitelio delle vie aeree, l'effetto di heregulin sulla crescita cellulare e la risposta al danno cellulare è stata valutata ^12. Questi tipi di sistemi modello forniscono un modo nuovo e utile per studiare l'inizio e la patogenesi dei tumori che derivano da tessuti epiteliali, e questo è di importanza critica in tessuti come il Financial Times in cui non esistono attualmente linee cellulari, e dove c'è una grande necessità per l'individuazione di percorsi principali e lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Collagen from human placenta (Bornstein and Traub Type IV)		Sigma	C7521
DMEM:F12 media		Cellgro	15-090-CV
Ultroser G		Crescent Chemical Company	67042	Add 20 ml of DMEM:F12 to stock bottle and use 10mls per 500 ml of media (2% final concentration)
Pen Strep		Invitrogen	15140-122
BD Primaria culture plates		BD Bioscience	353802
24 well Transwell Permeable supports		Corning (Costar)	3470	Clear, 6.5 mm insert, 0.4 μm pore size, treated polyester
MEM (Minimal Essential Media)		Cellgro	10-010-CV
Pronase		Roche	11459643001
DNAse		Sigma	DN25
Sall2 antibody		Dr T. Benjamin, Harvard	Gift	1:20 dilution
Pax8 antibody		Proteintech	10336-1-AP	1: 1000 dilution